Q: 合成DNA溶液在室溫下放置了數(shù)天，還可以使用嗎?
A: 溶液中的Oligo DNA常溫下數(shù)天（3-4天）應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，但最好不要放置一個(gè)星期以上。其壽命受溶液中的菌體、核酸酶等的影響。
Q: 怎樣理解測(cè)定的OD值?
A: 進(jìn)行OD值測(cè)定時(shí)，分光光度計(jì)上顯示的數(shù)值為每毫升溶液中的OD值。當(dāng)測(cè)定200 ml溶液中的OD值為1.5時(shí)，溶液整體的OD量應(yīng)該為多少？此時(shí)的OD值 = 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD。
Q: 怎樣對(duì)合成的DNA制品進(jìn)行定量?
A: DNA的量與260 nm處的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度計(jì)定量是最科學(xué)的。1個(gè)OD值的合成DNA的重量約為33 mg。
Q: 合成Oligo DNA應(yīng)怎樣保存?
A: 保存合成的Oligo應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：
1. 干燥制品很穩(wěn)定，常溫下數(shù)個(gè)月無(wú)問(wèn)題。但為保證萬(wàn)無(wú)一失，放置于-20℃保存為好。
2. 溶解后的溶液DNA短期內(nèi)（1-2周）使用可放置在4℃下保存，長(zhǎng)期保存請(qǐng)放置于-20℃。溶解DNA時(shí)，請(qǐng)注意使用無(wú)菌、無(wú)核酸酶的水或TE Buffer。
3. 熒光標(biāo)記引物請(qǐng)避光保存。
Q: 制品溶解后發(fā)現(xiàn)有少許沉淀，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎?
A: 所有的制品純化后都要進(jìn)行脫鹽，脫鹽是使用C18柱進(jìn)行的，偶而會(huì)有微量的樹(shù)脂溢出而進(jìn)入制品。樹(shù)脂不影響任何反應(yīng)結(jié)果，請(qǐng)稍許離心后取上清使用。
Q: 為什么PAGE級(jí)和高純度級(jí)制品的提供量比其他公司少?
A: 無(wú)論是PAGE純化，還是HPLC純化，增大每次的純化量會(huì)大大降低制品的純度。所以，為了保證制品質(zhì)量，我們一般把每次的純化量控制在2 OD左右。大OD量的提供對(duì)提高純度是不現(xiàn)實(shí)，不科學(xué)的做法。一般，1 OD的20mer的DNA制品 (約5 nmol)，可以進(jìn)行200-400 次的PCR反應(yīng) (50ml體系)，以及1,400次的測(cè)序反應(yīng)。因此，2 OD 的DNA量可以足夠進(jìn)行一般的實(shí)驗(yàn)工作。
Q: 我公司的DNA制品包裝中為什么不提供電泳照片?
A: 進(jìn)行過(guò)Oligo DNA PAGE電泳的人員都知道，同一OD量的不同序列的DNA制品電泳時(shí)的泳帶亮度（清晰度）是不一樣的。原因在于EtBr等染色劑的染色是滲透至DNA的雙鏈之間的，而合成的Oligo DNA是單鏈，Oligo DNA自身形成的立體結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，EtBr的染色就越容易，DNA帶也就越亮。相反，有一些Oligo DNA由于不形成立體結(jié)構(gòu)，根本就不為EtBr所染色。因此，我們認(rèn)為有些公司對(duì)所有產(chǎn)品都提供差不多同一亮度的制品的電泳照片是非常不現(xiàn)實(shí)的做法。
Q: 使用3%的Agarose凝膠電泳合成Oligo DNA制品，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶，為什么?
A: Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現(xiàn)多條泳帶（更無(wú)法用Agarose電泳進(jìn)行定量了)。
Q: 進(jìn)行PAGE電泳時(shí)，長(zhǎng)度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?
A: 我們分析后認(rèn)為主要有以下原因：
1. A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；
2. DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同。
這種情況在Oligo DNA越短時(shí)越容易發(fā)生，長(zhǎng)鏈Oligo DNA之間差別較小。
Q: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，為什么?
A: 大部分廠(chǎng)家的說(shuō)明是：1. PCR過(guò)程的錯(cuò)配；2. 克隆過(guò)程的突變。
我們不能否認(rèn)這種可能性，但這種可能性實(shí)在太小，幾乎不可能。對(duì)這種情況，我們經(jīng)過(guò)了認(rèn)真的分析，總結(jié)出了以下一些原因，供參考。
1. 合成機(jī)管路的瞬時(shí)阻堵，造成化學(xué)反應(yīng)的瞬間中斷，其結(jié)果可能會(huì)發(fā)生單個(gè)(或一部分)堿基的缺失。
2. 計(jì)算機(jī)程序失靈，控制錯(cuò)誤合成。
3. 合成過(guò)程中，堿基附加至DNA片段之前，堿基和堿基之間發(fā)生了偶聯(lián)，然后再附加到了DNA片段上，造成多堿基現(xiàn)象。
4. 合成時(shí)堿基G可能會(huì)轉(zhuǎn)化成烯醇異構(gòu)體，此時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)G會(huì)轉(zhuǎn)變成A。
5. 合成過(guò)程中的脫嘌呤作用，對(duì)脫嘌呤后的堿基DNA聚合酶不能識(shí)別，此時(shí)可能觀(guān)察到A或G的缺失。嘌呤含量越高，就越容易發(fā)生這種情況。
6. 不完全的脫保護(hù)結(jié)果。通常C脫得快，G脫得慢。不完全脫保護(hù)會(huì)發(fā)生堿基缺失。
7. 合成過(guò)程中的Capping（蓋帽）反應(yīng)不完全，使短片段DNA繼續(xù)參與合成，造成堿基缺失。
應(yīng)該說(shuō)，上述這些情況發(fā)生的可能性都極低。然而，合成的DNA鏈越長(zhǎng)，發(fā)生這種情況的機(jī)率也就越大。
Q: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，怎么辦?
A: 1. 因?yàn)橐锛兌炔豢赡苁?/span>100%，因此，挑選克隆時(shí)，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時(shí)，請(qǐng)重新挑選一個(gè)克隆測(cè)序，也許結(jié)果會(huì)變好。
2. 如果挑選2 ~ 3個(gè)克隆測(cè)序情況還沒(méi)改觀(guān)，我們會(huì)免費(fèi)重新合成引物。
Q:進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)個(gè)月不成功，后經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物處有錯(cuò)誤，怎么辦?
A: 1. 表達(dá)實(shí)驗(yàn)之前一定要對(duì)DNA序列進(jìn)行驗(yàn)證，這是實(shí)驗(yàn)的常識(shí)。
2. 我們可以免費(fèi)重新合成引物。
3. 如進(jìn)行索賠時(shí)，按國(guó)際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價(jià)格范圍之內(nèi)。
Q: 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性?
A: 1. 合成Oligo DNA時(shí)，選用高純度級(jí)制品。
2. 避免使用大于50mer的長(zhǎng)鏈Oligo DNA，最好選用小于35mer的合成DNA制品。
3. 進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次克隆都須進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以保證序列的正確性，然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，尤其需要注意。
Q: Oligo DNA最長(zhǎng)可以合成多少個(gè)堿基?
A: 以每步反應(yīng)效率為99%進(jìn)行計(jì)算，粗略計(jì)算合成到100個(gè)堿基時(shí)，目的DNA片段的比例便為0 (精確數(shù)為37.0%)。但有些廠(chǎng)家曾報(bào)道合成了150mer的Oligo DNA片段。TaKaRa公司也曾合成過(guò)120mer左右的Oligo DNA制品。但根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，要想保證合成DNA的堿基100%正確，Oligo DNA的長(zhǎng)度最好不要超過(guò)70mer，80mer以上要想保證一個(gè)堿基不錯(cuò)就非常危險(xiǎn)了，須十分注意。
Q: 一般的合成Oligo DNA的5'和3'末端有P嗎?
A: 沒(méi)有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加P，訂貨時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注明，此時(shí)需收取加P (P修飾) 的費(fèi)用。
Q: 平端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么?
A: 由于一般的PCR用引物的5'末端都沒(méi)有P，因此，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物的5'末端也沒(méi)有P。當(dāng)克隆于去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，無(wú)法克隆進(jìn)去；而當(dāng)克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，背景會(huì)極高。此時(shí)請(qǐng)對(duì)PCR產(chǎn)物的5'端進(jìn)行磷酸 (P) 化處理。
Q: 合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)無(wú)目的帶，怎么辦?
A: PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮。
1. 引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大?
2. 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu)，或者二條引物之間是否形成高次結(jié)構(gòu)?
3. PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作?
4. PCR儀是否工作正常?
5. PCR反應(yīng)條件是否合適?
Q: 進(jìn)行反義DNA (Antisense DNA) 實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否要對(duì)DNA鏈全部進(jìn)行S化修飾?
A: DNA經(jīng)S化修飾后比較穩(wěn)定，在細(xì)胞中不會(huì)被核酸酶等分解。如果整條鏈全部修飾成S化DNA，的確能增加DNA的穩(wěn)定性，但此時(shí)會(huì)降低DNA和目的模板結(jié)合的效率。因此，現(xiàn)在一般的科研人員通常采用將DNA片段兩端的數(shù)個(gè)堿基進(jìn)行S化修飾，這樣既能取得保護(hù)DNA的效果，又能增加Antisense DNA和目的模板的結(jié)合能力。即使如此，現(xiàn)在還是有很多科研人員采用了全部S化的修飾方法，并且能得到非常良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，任何一項(xiàng)科研工作都不是絕對(duì)的，因根據(jù)具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。
Q: Biotin標(biāo)記有三種，它們之間有何不同?
A: ss-Biotin可提供比較長(zhǎng)的連接臂（臂長(zhǎng)約24.3 A），方便了Biotin與Avidin間的結(jié)合，而且分子中含有S-S鍵，除可以用8M鹽酸胍（pH1.5）分離Biotin與Avidin外，還可以使用還原劑（50mM DTT或100mM巰基乙酸）進(jìn)行分離。Imino-Biotin可提供較短的連接臂（約13.5A），其最大特點(diǎn)是Biotin與Avidin的分離可在較溫和的條件下進(jìn)行；8M鹽酸胍（pH4.0）。普通的Biotin提供與ss-Biotin相似長(zhǎng)度的連接臂，但只能用8M鹽酸胍（pH1.5）分離Biotin與Avidin。
西亞試劑促銷(xiāo)
