Lab 的經(jīng)驗和客戶的難題

以華聯(lián)基因體實驗室的長期以來承接客戶RNA檢體的經(jīng)驗來說，我們經(jīng)常遇到的問題是(1)RNA的總量不夠，(2)RNA有嚴(yán)重的鹽類污染，(3)RNA有嚴(yán)重的有機溶劑污染，(4)DNA污染及(5)樣品降解嚴(yán)重(圖一圖二)。前四項問題都還好解決，只需要再次萃取或進行純化即可解決，但是樣品降解就較為棘手，常常因重新準(zhǔn)備檢體一來一往，耗掉不少心力和時間，最后也拿不到好的結(jié)果。
客戶經(jīng)常會問為什么執(zhí)行芯片實驗會如此要求RNA質(zhì)量呢?而其他的檢測方法如實時定量聚合連鎖反應(yīng)(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR) 卻不需要?
回答這個問題前就要從實驗的原理說起，簡單的講Q-PCR的檢測原理是針對要檢測的基因，設(shè)計一對基因特異性的引子，透過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)配合PCR的放大方式和及時偵測放大的產(chǎn)物量，藉以回推原始的RNA含量；而RT的方式主要是采用隨機引子(Random_primer)、進行互補DNA (cDNA)的翻制，因此即便RNA有些微裂解，作為模板的RNA也可以忠實的被翻制成cDNA。但是芯片實驗進行，主要是以放大和訊息RNA(mRNA)完全配對的互補RNA(cRNA) ，再進行雜合反應(yīng)，此步驟必須利用poly(dT)- T7啟動子序列和訊息RNA的poly(A)結(jié)合后，將T7啟動子序列連帶的鑲?cè)敕崔D(zhuǎn)錄的cDNA的5端，再經(jīng)由T7啟動子驅(qū)動試管內(nèi)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生合成反股的cRNA，再進行后續(xù)的芯片雜交的實驗?？上攵?，如果RNA有降解嚴(yán)重的現(xiàn)象，表示許多mRNA并不能忠實的被放大因此會產(chǎn)生許多偽陰性的結(jié)果。至此讀者心中可能就有一個概念了，假設(shè)Q-PCR和芯片被應(yīng)用在瞎子摸象的故事情節(jié)中，用Q-PCR的人只要能摸到大象的耳朵就可以說這里有大象，透過計算耳朵的數(shù)量就可以計算大象的數(shù)量；但是用芯片實驗方法的人，必須先確認所摸到的個體具備大象的完整特征，才能確確實實的說這里有一只大象。這也就說明了為何芯片實驗會如此要求RNA的質(zhì)量

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