西亞試劑：：樣品的準(zhǔn)備及雜交檢測

目前，由于靈敏度所限，多數(shù)方法需要在標(biāo)記和分析前對樣品進(jìn)行適當(dāng)程序的擴(kuò)增，不過也有不少人試圖繞過這一問題，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特異性強(qiáng)，無交叉污染并且省去了液相處理的煩瑣； Lynx Therapeutics 公司引入的大規(guī)模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一個樣品中同時對數(shù)以萬計的 DNA 片段進(jìn)行克隆，且無需單獨處理和分離每個克隆。
　　顯色和分析測定方法主要為熒光法，其重復(fù)性較好，不足的是靈敏度仍較低。目前正在發(fā)展的方法有質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等。以熒光法為例，當(dāng)前主要的檢測手段是激光共聚焦顯微掃描技術(shù)，以便于對高密度探針陣列每個位點的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。因為探針與樣品完全正常配對時所產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)度是具有單個或兩個錯配堿基探針的 5-35 倍，所以對熒光信號強(qiáng)度精確測定是實現(xiàn)檢測特異性的基礎(chǔ) ^[8] 。但熒光法存在的問題是，只要標(biāo)記的樣品結(jié)合到探針陣列上后就會發(fā)出陽性信號，這種結(jié)合是否為正常配對，或正常配對與錯配兼而有之，該方法本身并不能提供足夠的信息進(jìn)行分辨。
　　對于以核酸雜交為原理的檢測技術(shù)，熒光檢測法的主要過程為：首先用熒光素標(biāo)記擴(kuò)增（也可以有其它放大技術(shù)）過的靶序列或樣品，然后與芯片上的大量探針進(jìn)行雜交，將未雜交的分子洗去（如果用實時熒光檢測可省去此步 ^[9] ）這時，用落射熒光顯微鏡或其它熒光顯微裝置對片基進(jìn)行掃描，采集每點熒光強(qiáng)度并對其進(jìn)行分析比較。前已述及，由于正常的 Watson-Crick 配對雙鏈要比具有錯配堿基的雙鏈分子具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性。所以，如果探針與樣品分子在不位點配對有差異則該位點熒光強(qiáng)度就會有所不同，而且熒光信號的強(qiáng)度還與樣品中靶分子的含量呈一定的線性關(guān)系。當(dāng)然，由于檢測原理及目的不同，樣品及數(shù)據(jù)的處理也自然有所不同，甚至由于每種方法的優(yōu)缺點各異以至于分析結(jié)果不盡一致。

３．基因芯片技術(shù)的主要應(yīng)用

　　1998 年底美國科學(xué)促進(jìn)會將基因芯片技術(shù)列為 1998 年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一，足見其在科學(xué)史上的意義?，F(xiàn)在，基因芯片這一時代的寵兒已被應(yīng)用到生物科學(xué)眾多的領(lǐng)域之中。它以其可同時、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。這些應(yīng)用主要包括基因表達(dá)檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。在基因表達(dá)檢測的研究上人們已比較成功地對多種生物包括擬南芥（ Arabidopsis thaliana ） ^[10,11] 、酵母 (Saccharomyces cerevisiae)^[12,13] 及人 ^[15,16] 的基因組表達(dá)情況進(jìn)行了研究，并且用該技術(shù)（共 157,112 個探針分子）一次性檢測了酵母幾種不同株間數(shù)千個基因表達(dá)譜的差異 ^[14] 。實踐證明基因芯片技術(shù)也可用于核酸突變的檢測及基因組多態(tài)性的分析，例如對人 BRCA Ⅰ基因外顯子 11^[17] 、 CFTR 基因^{［ 22 ］} 、β - 地中海貧血 ^[24] 、酵母突變菌株間 ^[20] 、 HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因（與 Sanger 測序結(jié)果一致性達(dá)到 98% ） ^[21] 等的突變檢測，對人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定、作圖和分型 ^[19] ，人線粒體 16.6kb 基因組多態(tài)性的研究 ^[24] 等。將生物傳感器與芯片技術(shù)相結(jié)合，通過改變探針陣列區(qū)域的電場強(qiáng)度已經(jīng)證明可以檢測到基因（ ras 等）的單堿基突變 ^[26] 。此外，有人還曾通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進(jìn)行作圖 ^[25] 。雜交測序是基因芯片技術(shù)的另一重要應(yīng)用。該測序技術(shù)理論上不失為一種高效可行的測序方法，但需通過大量重疊序列探針與目的分子的雜交方可推導(dǎo)出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探針。基因芯片技術(shù)可以比較容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的問世無疑為雜交測序提供了實施的可能性，這已為實踐所證實 ^[27,28] 。

４．基因芯片技術(shù)的研究方向及當(dāng)前面臨的困難

　　盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、分析泛圍較狹窄等問題。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個方面。
　　樣品制備上，當(dāng)前多數(shù)公司在標(biāo)記和測定前都要對樣品進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增以便提高檢測的靈敏度，但仍有不少人在嘗試?yán)@過該問題，這包括 Mosaic Technologies 公司的固相 PCR 擴(kuò)增體系以及 Lynx Therapeutics 公司提出的大量并行固相克隆方法，兩種方法各有優(yōu)缺點，但目前尚未取得實際應(yīng)用。
探針的合成與固定比較復(fù)雜，特別是對于制作高密度的探針陣列。使用光導(dǎo)聚合技術(shù)每步產(chǎn)率不高（ 95% ），難于保證好的聚合效果。應(yīng)運而生的其它很多方法，如壓電打壓、微量噴涂等多項技術(shù)，雖然技術(shù)難度較低方法也比較靈活，但存在的問題是難以形成高密度的探針陣列，所以只能在較小規(guī)模上使用。最近我國學(xué)者已成功地將分子印章技術(shù)應(yīng)用于探針的原位合成而且取得了比較滿意的結(jié)果（個人通訊）。
　　目標(biāo)分子的標(biāo)記也是一個重要的限速步驟，如何簡化或繞過這一步現(xiàn)在仍然是個問題。
　　目標(biāo)分子與探針的雜交會出現(xiàn)一些問題：首先，由于雜交位于固相表面，所以有一定程度的空間阻礙作用，有必要設(shè)法減小這種不利因素的影響。 Southern 曾通過向探針中引入間隔分子而使雜交效率提高于了 150 倍。其次，探針分子的 GC 含量、長度以及濃度等都會對雜交產(chǎn)生一定的影響，因此需要分別進(jìn)行分析和研究。
　　信號的獲取與分析上，當(dāng)前多數(shù)方法使用熒光法進(jìn)行檢測和分析，重復(fù)性較好，但靈敏仍然不高。正在發(fā)展的方法有多種，如質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法等。基因芯片上成千上萬的寡核苷酸探針由于序列本身有一定程度的重疊因而產(chǎn)生了大量的豐余信息。這一方面可以為樣品的檢測提供大量的驗證機(jī)會，但同時，要對如此大量的信息進(jìn)行解讀，目前仍是一個艱巨的技術(shù)問題。

５．我國基因芯片的研究現(xiàn)狀

　　目前，我國尚未有較成型的基因芯片問世，但據(jù)悉已有幾家單位組織人力物力從事該技術(shù)的研制工作，并且取得了一些可喜的進(jìn)展。這是一件好事，標(biāo)志著我國相關(guān)學(xué)科與技術(shù)正在走向成熟?；蛐酒夹g(shù)是一個巨大的產(chǎn)業(yè)方向，我們國家的生命科學(xué)、計算機(jī)科學(xué)乃至精密機(jī)械科學(xué)的工作者們應(yīng)該也可以在該領(lǐng)域內(nèi)占有一席之地。但是我們應(yīng)該充分地認(rèn)識到，這不是一件輕易的事，不能夠蜂擁而至，不能“有條件沒有條件都要上”，去從事低水平重復(fù)性的研究工作，最終造成大量人力物力的浪費。而應(yīng)該是有組織、有計劃地集中具有一定研究實力的單位和個人進(jìn)行攻關(guān)，這也許更適合于我國國情。

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