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關(guān)鍵詞 基因芯片 雜交 檢測
隨著人類基因組（測序）計劃（ Human genome project ）的逐步實施以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得以測定，基因序列數(shù)據(jù)正在以前所未有的速度迅速增長。然而 , 怎樣去研究如此眾多基因在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能就成了全世界生命科學(xué)工作者共同的課題。為此，建立新型雜交和測序方法以對大量的遺傳信息進(jìn)行高效、快速的檢測、分析就顯得格外重要了。
基因芯片（又稱 DNA 芯片、生物芯片）技術(shù)就是順應(yīng)這一科學(xué)發(fā)展要求的產(chǎn)物，它的出現(xiàn)為解決此類問題提供了光輝的前景。該技術(shù)系指將大量（通常每平方厘米點陣密度高于 400 ）探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。早在八十年代， Bains W. 等人 [1] 就將短的 DNA 片斷固定到支持物上，借助雜交方式進(jìn)行序列測定。但基因芯片從實驗室走向工業(yè)化卻是直接得益于探針固相原位合成技術(shù)和照相平板印刷技術(shù)的有機結(jié)合以及激光共聚焦顯微技術(shù)的引入 [2] 。它使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計的探針分子切實可行，而且借助激光共聚焦顯微掃描技術(shù)使得可以對雜交信號進(jìn)行實時、靈敏、準(zhǔn)確的檢測和分析。正如電子管電路向晶體管電路和集成電路發(fā)展是所經(jīng)歷的那樣，核酸雜交技術(shù)的集成化也已經(jīng)和正在使分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)生著一場革命。現(xiàn)在全世界已有十多家公司專門從事基因芯片的研究和開發(fā)工作，且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。主要代表為美國 Affymetrix 公司。該公司聚集有多位計算機、數(shù)學(xué)和分子生物學(xué)專家，其每年的研究經(jīng)費在一千萬美元以上，且已歷時六七年之久，擁有多項專例。產(chǎn)品即將或已有部分投放市場，產(chǎn)生的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益令人瞻目。
基因芯片技術(shù)由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交（ Southern Blotting 和 Northern Blotting 等）技術(shù)操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設(shè)計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價值，如基因表達(dá)譜測定、實變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。
1 ．基因芯片的主要類型
目前已有多種方法可以將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。這些方法總體上有兩種，即原位合成（ in situ synthesis ）與合成點樣兩種。支持物有多種如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護(hù)基建立共價連接；作點樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等。
原位合成法主要為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（ Light-directed synthesis ），它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引導(dǎo)聚合技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)（ photolithography ）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。半導(dǎo)體技術(shù)中曾使用照相平板技術(shù)法在半導(dǎo)體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術(shù)是當(dāng)前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術(shù)成熟且已實現(xiàn)自動化。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽陣列提供了一條快捷的途徑。
以合成寡核苷酸探針為例，該技術(shù)主要步驟為：首先使支持物羥基化，并用光敏保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)起來。每次選取擇適當(dāng)?shù)谋喂饽ぃ?mask ）使需要聚合的部位透光，其它部們不透光。這樣，光通過蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基解保護(hù)。因為合成所用的單體分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護(hù)基的保護(hù)，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應(yīng)后仍舊帶有光敏保護(hù)基團(tuán)。因此，每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類和反應(yīng)次序就可以實現(xiàn)在待定位點合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的 [3 ， 4] 。
該方法的主要優(yōu)點是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列。例如，合成 48 （ 65536 ） 個探針的 8 聚體寡核苷酸序列僅需 4 × 8=32 步操作， 8 小時就可以完成。而如果用傳統(tǒng)方法合成然后點樣，那么工作量的巨大將是不可思議的。同時，用該方法合成的探針陣列密度可高達(dá)到 106/cm2 。不過，盡管該方法看來比較簡單，實際上并非如此。主要原因是，合成反應(yīng)每步產(chǎn)率比較低，不到 95% 。而通常固相合成反應(yīng)每步的產(chǎn)率在 99% 以上 [5] 。因此，探針的長度受到了限制。而且由于每步去保護(hù)不很徹底，致使雜交信號比較模糊，信噪比降低。為此有人 [6] 將光引導(dǎo)合成技術(shù)與半異體工業(yè)所用的光敏抗蝕技術(shù)相結(jié)合，以酸作為去保護(hù)劑，使每步產(chǎn)率增加到 98% 。原因是光敏抗蝕劑的解離對照度的依賴是非線性的，當(dāng)照度達(dá)到特定的閾值以上保護(hù)劑就會解離。所以，該方法同時也解決了由于蔽光膜透光孔間距離縮小而引起的光衍射問題，有效地提高了聚合點陣的密度。另據(jù)報導(dǎo) [7] ，利用波長更短的物質(zhì)波如電子射線去除保護(hù)可使點陣密度達(dá)到 1010/cm2 。
除了光引導(dǎo)原位合成技術(shù)外，有的公司如美國 Incyte Pharmaceuticals 等使用壓電打印法 (Piezoelectric printing) 進(jìn)行原位合成。其裝置與普通的彩色噴墨打印機并無兩樣，所用技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。做法是將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑所替代，支持物經(jīng)過包被后，通過計算機控制噴墨打印機將特定種類的試劑噴灑到預(yù)定的區(qū)域上。沖洗、去保護(hù)、偶聯(lián)等則同于一般的固相原位合成技術(shù)。如此類推，可以合成出長度為 40 到 50 個堿基的探針，每步產(chǎn)率也較前述方法為高，可達(dá)到 99% 以上。
盡管如此，通常原位合成方法仍然比較復(fù)雜，除了在基因芯片研究方面享有盛譽的 Affymetrix 等公司使用該技術(shù)合成探針外，其它中小型公司大多使用合成點樣法。
后一方法在多聚物的設(shè)計方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的 DNA 或多肽固相合成儀完成，只是合成后用特殊的自動化微量點樣裝置將其以比較高的密度涂布于硝酸纖維膜、尼龍膜或玻片上。支持物應(yīng)事先進(jìn)行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷。現(xiàn)在已有比較成型的點樣裝置出售，如美國 Biodot 公司的點膜產(chǎn)品以及 Cartesian Technologies 公司的 PixSys NQ/PA 系列產(chǎn)品。前者產(chǎn)生的點陣密度可以達(dá)到 400/cm2 ，后者則可達(dá)到 2500/cm2 。
２．樣品的準(zhǔn)備及雜交檢
