西亞試劑：：Electrophoretic Mobility Shift Assay

凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，最初用于研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。

其基本原理是蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合，電泳時這種復(fù)合物比無蛋白結(jié)合的探針在凝膠中泳動的速度慢，即表現(xiàn)為相對滯后。該方法可用于檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白，并可通過加入特異性的抗體（supershift）來檢測特定的蛋白質(zhì)，并可進(jìn)行未知蛋白的鑒定。
生物體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成RNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵過程，基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。近年來，基因分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的趨勢之一是逐漸從基因結(jié)構(gòu)和功能分析轉(zhuǎn)到基因順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理上，對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究將是今后相當(dāng)長一段時期內(nèi)功能基因組學(xué)研究的熱點之一。

在轉(zhuǎn)錄水平，基因的轉(zhuǎn)錄行為是由順式作用元件（cis-acting elements）和反式作用因子（trans-acting factors）（即轉(zhuǎn)錄因子）相互作用調(diào)控的，因此要探討基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，分離、鑒定基因的位點控制區(qū)（loci control region，LCR）中順式作用元件和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要。但僅僅如此還不夠，對于基因表達(dá)調(diào)控，必須從三個層次展開：一是分離和鑒定基因5＇端核心啟動子等順式作用元件，二是分離和鑒定與各順式作用元件相對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，三是檢測各順式作用元件與對應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。鑒定順式調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子是研究得比較多的內(nèi)容，而對于順式作用元件與對應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用這個層次的研究相對較為薄弱。電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，它正是對第三個層次進(jìn)行研究的技術(shù)之一，核心功能是驗證蛋白質(zhì)與特定核酸序列的結(jié)合特性，從而間接推斷已知蛋白質(zhì)的靶序列或已知序列的結(jié)合蛋白分子。

我們知道，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)已經(jīng)很容易實現(xiàn)高通量分析，但在功能研究這個層次上，目前還沒有真正高通量的分析技術(shù)出現(xiàn)。技術(shù)的缺乏是后基因組學(xué)時代功能研究的主要瓶頸。和其他功能研究技術(shù)一樣，電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）本身也存在諸多缺點，比如對于低親和力結(jié)合很難進(jìn)行鑒定；難以比較不同片斷之間親和力大小的差異；對于蛋白復(fù)合體與DNA的結(jié)合也無法鑒定。由于體外環(huán)境和體內(nèi)環(huán)境存在巨大的差異，電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）很難真正重建體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA之間結(jié)合過程。對EMSA進(jìn)行改良或發(fā)展更好的研究蛋白質(zhì)與DNA互作的技術(shù)很有必要。

簡單說明一下EMSA技術(shù)的優(yōu)缺點，基本原理和實驗方法。
Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
Introduction
Advantage：
can separate different types of complexes, such as monomer and dimer => better than filter binding
easier to see the complex than footprint assay
Disadvantage: do not know where the binding site is.

Rationale
DNA-protein complex will have a smaller mobility than that of free DNA on native gel
gel electrophoresis and molecular sieve
cage effect - difference between footprint and EMSA
Data interpretation
nonspecific binding
smearing between DNA and complex bands

Methods
Lable DNA
Mix DNA and protein to form complex
Add nonspecific competitor
Separate complex with free probe on a native gel

這里只提供了方法的基本的路線，具體操作可以參考：
http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/search.cgi?catid=&query=EMSA&submit2=Search
 

下面是在一個PROTOCAL

1.探針的標(biāo)記：
（1）如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：
待標(biāo)記探針（1.75pmol/微升）2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升）1微升
總體積 10微升
按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。
（2）使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。
（3）加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。
（4）再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30％以上，即總放射性的30%以上標(biāo)記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。
（5）標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

2. 探針的純化：
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：
（1）對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。
（2）在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。
（3）在4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。
（4）在4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。
（5）加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在 -20℃。

3.EMSA 膠的配制：
（1）準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞?。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。
（2）按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大）。
TBE buffer （10X）1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%，w/v）2毫升
80% 甘油 625微升
10% 過硫酸銨 （ammonium persulfate）150微升
TEMED 10微升
（3）按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。

4.EMSA結(jié)合反應(yīng)：
（1）如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：
陰性對照反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 0微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
樣品反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
探針冷競爭反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
突變探針的冷競爭反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的突變探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
Super-shift反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
目的蛋白特異抗體 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
（2）按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫（20-25℃）放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫（20-25℃）放置20分鐘。
（3）加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色，10X），混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。

5.電泳分析：
（1）用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍(lán)色），以觀察電壓是否正常進(jìn)行。
（2）把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 （藍(lán)色），用于觀察電泳進(jìn)行的情況。
（3）按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。
（4）剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板），把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘），輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。
（5）干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛