西亞試劑：：純合克隆篩選

融化雜合突變ES細(xì)胞，ES/LIF培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3天傳代，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始把細(xì)胞接種到三個(gè)100mm鋪有凝膠碟皿中，每皿接種1～2×106細(xì)胞。為篩選需用一個(gè)以上的ES雜合突變細(xì)胞系，因不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化效率不全相同，另外對(duì)檢測(cè)細(xì)胞表型也需如此。

2．每皿細(xì)胞分別加入1.0～2.0mg/ml的G4178（終濃度，pH7.4）；應(yīng)用neo和hyg基因作為篩選標(biāo)記效果都很好，用hyg時(shí)濃度為1.0～2.0mg/ml的hygromycin-β的ES/LIF培養(yǎng)液。

3．培養(yǎng)細(xì)胞7～10天，每天換液，仍用含有適當(dāng)濃度G418的ES/LIF培養(yǎng)液，培養(yǎng)至出現(xiàn)很多單個(gè)克隆為止；如細(xì)胞已長(zhǎng)滿而未出現(xiàn)單個(gè)克隆時(shí)，應(yīng)重復(fù)2，并加大G418濃度。

4．按前述雜合突變所述15～21步篩選法進(jìn)行克隆篩選；在出現(xiàn)有雜交片段表示在純合突變細(xì)胞中不存在無(wú)改變的靶基因。典型情況下，應(yīng)有50％為純合的，這是因?yàn)榇诉^(guò)程是隨機(jī)的，個(gè)別雜合克隆也可能產(chǎn)生純合克隆。

5．進(jìn)行Northern分析mRNA，或用免疫吸印分析蛋白質(zhì)，以確定靶基因是否表達(dá)。應(yīng)是抑活的，即不表達(dá)，也不應(yīng)有正常mRNA或蛋白質(zhì)

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛