西亞試劑：：在質(zhì)粒載體中進(jìn)行平末端片段的克隆

在質(zhì)粒載體中進(jìn)行平末端片段的克隆

1．分別設(shè)立兩個(gè)反應(yīng)，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化1~10μg質(zhì)粒DNA和外源DNA片段，使它們能產(chǎn)生平末端。

2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。

3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml。 假設(shè)1 bp相當(dāng)于660 Da，計(jì)算DNA的終濃度（pmol/ml）。

4．將載體DNA去磷酸化。

5．按下表將適量的DNA轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的0.5 ml離心管：

   

管號(hào)
 DNA
 
A和E
 載體1 [60fmol (~100ng)]
 
B
 外源插入片段2[60fmol (~10ng)]
 
C和F
 載體1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol）
 
D
 線狀載體（5’-磷酸化）（60fmol）
 
G
 環(huán)狀載體[60fmol (~10ng)]
 

1 載體DNA已進(jìn)行去磷酸化

2 外源目的DNA可以連接接頭。

3 連接反應(yīng)中，質(zhì)粒載體和插入的DNA片段摩爾比一般為1：1。DNA的總濃度應(yīng)約為10ng/μl。

 

a.       A、B和C管中加入：

   10×連接緩沖液      1.0μl

   T4噬菌體連接酶      0.5 Weiss單位

   5 mmol/L ATP        1.0μl

   H2O                  補(bǔ)至8.5μl

   30%PEG 8000          1~1.5μl

b.      D、E和F管中加入：

   10×連接緩沖液      1.0μl

   5 mmol/L ATP         1.0μl

   H2O                  補(bǔ)至8.5μl

   30%PEG 8000          1~1.5μl

   不加DNA酶

 

6．連接反應(yīng)體系置于16℃水浴溫育過(guò)夜或20℃水浴溫育4 h。

7．用每份稀釋的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)包括用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的已知量的超螺旋質(zhì)粒DNA作為對(duì)照，以檢查轉(zhuǎn)化效率。

管號(hào)
 DNA
 連接酶（有/無(wú)）
 預(yù)期轉(zhuǎn)化克隆數(shù)
 
A
 載體1
 +
 ~03
 
B
 插入片段
 +
 0
 
C
 載體1和插入片段
 +
 比F管高5倍
 
D
 載體1
 -
 ~0
 
E
 載體2
 -
 比D管高50倍
 
F
 載體和插入片段
 -
 比D管高50倍
 
G
 環(huán)狀質(zhì)粒
 -
 2×105
 

1 去磷酸化

2 未去磷酸化

3 如果出現(xiàn)來(lái)自去磷酸化的載體DNA自身連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子，是由于用堿性磷酸酶處理時(shí)未能除盡5’端的磷酸基