西亞試劑：：PCR產(chǎn)物的克隆

在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的DNA片段。此時(shí),所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小,以減少平臺(tái)效應(yīng)或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法。
　　1. 平末端連接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。
　　2. 在PCR產(chǎn)物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會(huì)在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對(duì)A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個(gè)ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團(tuán)可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個(gè)切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前一些公司已開(kāi)發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。
　　3. 粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。
 

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛