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1. 變性：在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR失敗,因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富含GC的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。
2. 退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高,長度長并與模板完全配對時, 應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高, 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環(huán), 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時間主要是為使整個反應(yīng)體系達到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37℃-55℃,1-2min。
3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。延伸時間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時間。一般在擴增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對以后進行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。
4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴增后, 反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時產(chǎn)物量仍不夠, 需要進一步擴增, 可將擴增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進行擴增, 這樣經(jīng)60輪循環(huán)后, 擴增水平可達109-1010 。
擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關(guān),擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C為擴增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA量, P為增效率, n為循環(huán)次數(shù)。
在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。
