西亞試劑：：PCR/RT-PCR指南---PCR產(chǎn)物克隆

 
  PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切與連接法，雜交法和近期開發(fā)出來(lái)的特異性重組法等。
但因?yàn)門A克隆法操作最簡(jiǎn)單，快速和高效的原因，成為Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen發(fā)明，并擁有全球TA Cloning商標(biāo)的專利權(quán)。

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）

利用Taq聚合酶同時(shí)具有的末端連接酶的功能，在每條PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3`端自動(dòng)添加一個(gè)3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系統(tǒng)和Topo TA克隆系統(tǒng)都提供一個(gè)線性含3`-T突出端的載體用于直接高效地連接PCR產(chǎn)物。系統(tǒng)中也包含感受態(tài)細(xì)胞和S.O.C培養(yǎng)基, 使得實(shí)驗(yàn)操作更為簡(jiǎn)單方便。

所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需將PCR產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，不需把PCR產(chǎn)物做平端處理（Invitrogen另有平端載體供高確限度酶克?。２恍柙赑CR擴(kuò)增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進(jìn)行克隆。

圖32 The TA Cloning® Concept
 
 

Topo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit）

Topo TA克隆原理與TA克隆一樣，唯一不同的是TA克隆用的是T4連接酶把PCR片斷連接到T載體上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。

Topoisomerase的用途一般使用在復(fù)制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再連接成線性DNA。

Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效連接的特性把含3`A端的PCR擴(kuò)增片斷快速連接到3`T端載體上，整個(gè)反應(yīng)只需五分鐘！一般T4連接酶需過(guò)夜才能高效連接。Topo TA克隆系統(tǒng)提供Topoisomerase I載體，感受態(tài)細(xì)胞，SOC培養(yǎng)基等。

1. Add 1ml of TOPO® Cloning vector to 1ml of the Taq-amplified PCR product   2. Incubate for 5 minutes on your bench top   3. Transform One Shot® Competent E. coli.
 
 

Topo平端克隆方法和長(zhǎng)PCR片斷克隆法（Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit）（Topo XL PCR Cloning Kit）

因?yàn)樵絹?lái)越多高確限度熱穩(wěn)定酶如Pfx、Pfu被用于PCR擴(kuò)增，使到PCR后都只是平端產(chǎn)物。這種平端克隆往往效率低，并且有非特異性背景菌落產(chǎn)生，造成篩選困難。

Topo平端克隆主要改良載體設(shè)計(jì)，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果沒(méi)有DNA片斷插入，ccdB基因則會(huì)表達(dá)，ccdB基因的表達(dá)蛋白，會(huì)破壞細(xì)菌的DNA gyrase，造成細(xì)菌染色體的降解導(dǎo)致細(xì)菌死亡。如果有插入片斷，則ccdB基因表達(dá)受到阻礙，所以細(xì)胞可生長(zhǎng)。這樣可以把高背景的缺點(diǎn)改善，節(jié)省篩選的時(shí)間。Topo平端克隆與Topo TA方法一樣，操作簡(jiǎn)單快速。

平端PCR克隆方法（Zero Blunt PCR Cloning Kit）

Zero Blunt PCR克隆乃利用傳統(tǒng)T4連接酶方法，但載體和Topo平端的一樣，含ccdB基因，所以同樣可降低菌落背景，易于篩選。

表10 PCR克隆試劑盒的選擇  Amplification Enzyme Application of Cloned PCR Product Ligation Method Product Advantages Cat. No.
Taq DNA Polymerase •Sequencing
•Safeguarding sample
•In vitro transcription TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase TOPO TA Cloning® Kit •≥95% recombinants K4500-01
K4550-01
K4560-01
•Blue/white color screening
TOPO TA Cloning® Kit Dual Promoter •≥95% recombinants K4600-01
K4650-01
K4660-01
•Blue/white color screening
•Dual Sp6 and T7 promoter primer sites for in vitro transcription
TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing •≥95% recombinants K4575-01
•Streamlined sequence analysis
Ligase-mediated(overnight)T4 DNA ligase Original TA Cloning® Kit •≥80% recombinants K2000-10
K2030-10
•Blue/white color screening
Original TA Cloning® Kit Dual Promoter •≥80% recombinants K2050-01
K2060-01
•Blue/white color screening
•Dual Sp6 and T7 promoter/primers sites for in vitro transcription
TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase Various •Fast cloning directly into an expression vector All the TOPO Exp. Kits
Proofreading polymerase高確限度酶 •Expression of cloned PCR product TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit •≥95% recombinants K2800-20
•Positive selection resulting in low background
Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing •≥95% recombinants K2875-20
•Positive selection resulting in low background
•Streamlined sequence analysis
Ligase-mediated(1 hour)T4 DNA ligase Zero Blunt® PCR Cloning Kit •≥95% recombinants K2700-20
•Positive selection resulting in low background
Polymerase mixturesfor long Template混合酶 •Sequencing
•Safeguarding sample
•In vitro transcription TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase TOPO® XL PCR Cloning Kit •High-efficiency cloning of long (3-10kb) PCR products K4700-10
•Positive selection resulting in low background
 

TOPO PCR表達(dá)克隆法

傳統(tǒng)限制酶切法必須把目標(biāo)片段切下來(lái)再連接至表達(dá)載體上，這會(huì)導(dǎo)致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，從而影響蛋白表達(dá)和蛋白的功能。利用TOPO克隆技術(shù)把PCR產(chǎn)物直接克隆至表達(dá)載體，則可避免這種情況。

Comparison of Cloning Strategies
 
 
 

TOPO PCR表達(dá)克隆法仍利用特異引物把目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把產(chǎn)物快速連接到T表達(dá)載體上，這是到載體上的目標(biāo)基因不含非編碼區(qū)，Invitrogen提供了原核細(xì)胞、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種PCR克隆表達(dá)系統(tǒng)。