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本方法的核心部分是醫(yī)科院基礎(chǔ)所的生化脂蛋白組的吳剛老師所創(chuàng)，我在其基礎(chǔ)上進行了一些改動，主要是DNA回收上采取了更簡單的方法。（本方法最適用于雙酶切制作片斷并進行克隆的情況。對于分步酶切制作片斷，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）
一、片斷平移的克隆（也適用于多片斷連接）
簡介：將用作載體的質(zhì)粒A（制作大片斷）酶切3μL ，要切出小片斷的質(zhì)粒B酶切7μL；瓊脂糖回收膠電泳；切膠回收來自質(zhì)粒A的大片段，和來自B的小片斷，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃過夜；次日轉(zhuǎn)化涂板。
酶切
配置可酶切共10μL質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系（雙酶切）：
（提示 在克隆設(shè)計時盡量使用好切的內(nèi)切酶<通常是效價高、便宜量大的酶>，且注意這兩個酶有比較兼容的Buffer，即在這種公用Buffer中，兩酶的效力變化不大<至少保持60%的活性>。酶切體系根據(jù)需要，可加入BSA。）
酶切體系
A質(zhì)粒酶切－制作載體片斷
公用Buffer 3μL
酶 I 1μL
酶 II 1μL
質(zhì)粒 3μL
雙蒸水 22μL
合計 30μL
B質(zhì)粒酶切－制作插入片斷
公用Buffer 7μL
酶 I 2μL
酶 II 2μL
質(zhì)粒 7μL
雙蒸水 52μL
合計 70μL
混勻
37℃，酶切3小時。
（提示 關(guān)于酶量的問題。通常的內(nèi)切酶效價在10U/μL左右，3μL內(nèi)切酶相當于30U，足夠切10μL的質(zhì)粒。因為通常小提質(zhì)粒的濃度在200－600ng/μL，一般濃度達不到1μg/μL。根據(jù)1U酶切1μg質(zhì)粒的原則，這一酶量是足夠的。）
1%瓊脂糖回收膠回收（碎膠、酚氯仿抽提法）
1. 酶切產(chǎn)物加入10％量的上樣Buffer，混勻。使用1%的瓊脂糖回收膠，電泳回收酶切產(chǎn)物。
2. 用手術(shù)刀切下所需要的大片斷（載體）和小片斷（插入片斷），收入一個1.5mL離心管中。（提示: 切膠前，需用分別含酒精、NaOH和雙蒸水的紙巾擦拭凝膠接觸的臺面，以防污染。 手術(shù)刀要火焰消毒，而后切膠回收。）
3. 12000rpm 1分鐘，將凝膠甩到管底。 -20℃ 冰凍20分鐘。
4. 取200μL Tip 頭兩只，在酒精燈上稍烤化Tip頭尖端，兩Tip頭尖相對來回相接觸，在Tip頭頂部制成直徑3mm左右的平頭，準備用于碎膠。
5. 從-20℃取出凍結(jié)的凝膠，立即使用200μL槍套上平頭Tip頭，搗碎凝膠。（提示 200μL的槍足夠粗壯，不要用100μL的槍，小心折斷！?。?乘凝膠比較硬時就開始碎膠，輕而頻率高地搗碎凝膠）
6. 凝膠管中加入500μL雙蒸水，蓋緊，振搖200下。
7. 加入500μL Tris飽和純酚，蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心15分鐘。
8. 在一新1.5mL 離心管中加入 500μL 氯仿：異戊醇（24：1），將步驟7的上清加入本步驟離心管中。蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心5分鐘。
9. 在一新1.5mL 離心管中加入 900μL 預(yù)冷 無水乙醇、20μL 3M的醋酸鈉。將步驟8的上清小心加入本步驟離心管中。顛倒數(shù)次混勻。12000rpm 4℃ 離心15分鐘。（提示 吸取步驟8中的上清時，千萬不要將有機相吸入，寧可放棄一些上清，否則影響后面的連接反應(yīng)。 另外，本方法使用的醋酸鈉量較小，但足夠沉淀核酸，并且無需洗鹽。）
10. 棄上清，將離心管倒置于干凈吸水紙巾上5分鐘。室溫下吹風(fēng)干燥。（提示 可將試管至于超凈臺吹風(fēng)干燥。如果管底有較多液體聚集，可蓋好管蓋后，輕彈管底數(shù)次，將液體分散掛在管壁上，再打開管蓋吹風(fēng)。）
連接
向回收DNA的試管中加入8μL 雙蒸水，蓋緊，彈擊管底使液體盡量接觸管壁。瞬時離心將液體甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（連接酶）。彈擊管壁混勻，瞬時離心將液體甩到管底。 置4℃過夜。 （提示 Ligase Buffer應(yīng)該在首次融解后分裝，每管可2-3μL，-20℃存儲。 4℃過夜可獲得最多的轉(zhuǎn)化克隆。）
二、PCR產(chǎn)物接入質(zhì)粒的克隆
簡介： 取100μL PCR產(chǎn)物，酒精沉淀、干燥，直接加入酶切體系酶切；將用作載體的質(zhì)粒A（制作大片斷）酶切3μL；切膠回收來自質(zhì)粒A的大片段，和來自PCR產(chǎn)物的小片斷，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃過夜；次日轉(zhuǎn)化涂板。
PCR產(chǎn)物回收
1. 制備100μL PCR產(chǎn)物。
2. 將100μL PCR產(chǎn)物加入一1.5mL離心管中，再加入400μL雙蒸水，顛倒混勻。加入 900μL 預(yù)冷 無水乙醇、20μL 3M的醋酸鈉。顛倒數(shù)次混勻。（提示 本方法使用的醋酸鈉量較小，但足夠沉淀核酸，并且無需洗鹽。）
3. 4℃靜置30分鐘，以利于核酸沉淀。
4. 12000rpm 4℃ 離心15分鐘，沉淀核酸。
5. 棄上清，將離心管倒置于干凈吸水紙巾上5分鐘。室溫下吹風(fēng)干燥。（提示 可將試管至于超凈臺吹風(fēng)干燥。如果管底有較多液體聚集，可蓋好管蓋后，輕彈管底數(shù)次，將液體分散掛在管壁上，再打開管蓋吹風(fēng)。）
酶切
直接在回收PCR產(chǎn)物的試管中配置酶切體系：
PCR產(chǎn)物酶切－制作插入片斷
公用Buffer 6μL
酶 I 3μL
酶 II 3μL
PCR產(chǎn)物 ——
雙蒸水 48μL
合計 60μL
要將PCR產(chǎn)物接入的質(zhì)粒載體A，取A質(zhì)粒3μL進行酶切。
A質(zhì)粒酶切－制作載體片斷
公用Buffer 3μL
酶 I 1μL
酶 II 1μL
質(zhì)粒 3μL
雙蒸水 22μL
合計 30μL
混勻
37℃，酶切3小時。
1%瓊脂糖回收膠回收（碎膠、酚氯仿抽提法）
1. 酶切產(chǎn)物加入10％量的上樣Buffer，混勻。使用1%的瓊脂糖回收膠，電泳回收酶切產(chǎn)物。
2. 用手術(shù)刀切下所需要的大片斷（載體）和小片斷（插入片斷），收入一個1.5mL離心管中。 （提示 切膠前，需用分別含酒精、NaOH和雙蒸水的紙巾擦拭凝膠接觸的臺面，以防污染。 手術(shù)刀要火焰消毒，而后切膠回收。）
3. 12000rpm 1分鐘，將凝膠甩到管底。 -20℃ 冰凍20分鐘。
4. 取200μL Tip 頭兩只，在酒精燈上稍烤化Tip頭尖端，兩Tip頭尖相對來回相接觸，在Tip頭頂部制成直徑3mm左右的平頭，準備用于碎膠。
5. 從-20℃取出凍結(jié)的凝膠，立即使用200μL槍套上平頭Tip頭，搗碎凝膠。（提示 200μL的槍足夠粗壯，不要用100μL的槍，小心折斷?。?！ 乘凝膠比較硬時就開始碎膠，輕而頻率高地搗碎凝膠）
6. 凝膠管中加入500μL雙蒸水，蓋緊，振搖200下。
7. 加入500μL Tris飽和純酚，蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心15分鐘。
8. 在一新1.5mL 離心管中加入 500μL 氯仿：異戊醇（24：1），將步驟7的上清加入本步驟離心管中。蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心5分鐘。
9. 在一新1.5mL 離心管中加入 900μL 預(yù)冷 無水乙醇、20μL 3M的醋酸鈉。將步驟8的上清小心加入本步驟離心管中。顛倒數(shù)次混勻。12000rpm 4℃ 離心15分鐘。（提示 吸取步驟8中的上清時，千萬不要將有機相吸入，寧可放棄一些上清，否則影響后面的連接反應(yīng)。 另外，本方法使用的醋酸鈉量較小，但足夠沉淀核酸，并且無需洗鹽。）
10. 棄上清，將離心管導(dǎo)致于干凈吸水紙巾上5分鐘。室溫下吹風(fēng)干燥。（提示 可將試管至于超凈臺吹風(fēng)干燥。 如果管底有較多液體聚集，可蓋好管蓋后，輕彈管底數(shù)次，將液體分散掛在管壁上，再打開管蓋吹風(fēng)）
連接
向回收DNA的試管中加入8μL 雙蒸水，蓋緊，彈擊管底使液體盡量接觸管壁。瞬時離心將液體甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（連接酶）。彈擊管壁混勻，瞬時離心將液體甩到管底。 置4℃過夜。 （提示 Ligase Buffer應(yīng)該在首次融解后分裝，每管可2-3μL，-20℃存儲。 4℃過夜可獲得最多的轉(zhuǎn)化克隆。）
三、 一步法感受態(tài)細胞制作（已經(jīng)檢驗過DH5α和BL21系菌，采用此方法的轉(zhuǎn)化效率足夠高）
來自Nucleic Acid Research 1988 16 3580
Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.
Chung CT, Miller RH.
下載鏈接：http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520&pageindex=1
（提示：建議首次使用本方法時，先培養(yǎng)20mL菌，可得到總數(shù)2mL的感受態(tài)菌，足夠作30次轉(zhuǎn)化。制作感受態(tài)細胞時注意無菌操作。）
1. LB medium 培養(yǎng)至 OD值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g（或6000rpm） 5分鐘。棄上清，收菌。
3. 重懸于原培養(yǎng)體積1/10的TSB中。
4. 冰上置10分鐘。 分裝，每管60μL，置冰上。放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一管，避免反復(fù)凍融。 －70℃可保存一年不影響轉(zhuǎn)化效率）
TSB配方（需高壓）：
LB （PH6.1）
10% PEG 3350
5% DMSO
10mM MgCI2
10mM MgSO4
10％ 甘油
* TSB 的配置同原文稍有改動，即把甘油加入TSB并一起高壓（簡化步驟）。實踐數(shù)次證明對于感受態(tài)制備沒有影響。
5×KCM溶液配方：（配置數(shù)毫升即可，－20 ℃保存，可反復(fù)凍融）
0.5 M KCI
0.15M CaCl2
0.25M MgCI2
轉(zhuǎn)化Protocol：
1. 連接產(chǎn)物10μL、5×KCM溶液10μL、雙蒸水30μL，（共50μL）混勻，置冰上。
2. 從-70℃冰箱中取 1支感受態(tài)細胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步驟1中的混合液中，輕輕吹打數(shù)次混勻（不可用力過大，不可渦旋）， 立即置冰上。
3. 冰上放置20 分鐘。
4. 室溫放置10分鐘。
5. 加入500μL新鮮LB， 150轉(zhuǎn)37 ℃ 1小時。
6. 6000轉(zhuǎn)/分 5分鐘離心收菌。留150μL上清（其余上清丟棄），吹打數(shù)次，重懸菌體。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱過夜。
（提示：可使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細菌，檢驗轉(zhuǎn)化效率。1μL的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，DH5α菌板滿板不可計數(shù)；BL21菌板有200－300個菌落。）
小結(jié)：
本方法采用簡潔的步驟。最有特點的地方是片斷回收后收到一個試管中，而不象一般的操作分別收到不同的試管中，回收后再電泳定量，并計算大小片斷的比例，最后配置連接體系。
這種簡潔的步驟不僅提高效率、避免引入人為的誤差（例如肉眼對DNA的定量的誤差），還減少了DNA的損失，保證了更多的DNA（實際上是全部的DNA）進入下面的連接反應(yīng)。
所以本方法的第一個優(yōu)點，是保證連接和轉(zhuǎn)化中，有“足夠量”的核酸。 連接和轉(zhuǎn)化的核酸量得到保證，克隆成功就得到保證。
例如本方法中，制作大片斷的A質(zhì)粒取3μL，對于通常的小提質(zhì)粒，3μL意味者600－1800ng的DNA。一般認為大片段的適當范圍是50－200ng/10μL連接反應(yīng)。本方法即使在回收過程中損失一半，仍然剩300－900ng。實際上，使用本方法，在片斷平移的克隆中，如果把轉(zhuǎn)化的菌液全部涂板，得到的克隆多得不可計數(shù)；片斷平移克隆實際上只取一半轉(zhuǎn)化菌涂板即可。 PCR接入載體的克隆效率沒有那么高，但是一般也達到40－60轉(zhuǎn)化子/平板。
本方法的另一優(yōu)點，是這些看起來固定的步驟，例如酶切、酶連、以及轉(zhuǎn)化等方案，實際上已經(jīng)遵循了很多原則，而且這些步驟之間互相平衡，組成一個很穩(wěn)定和可操作性很強的系統(tǒng)。
例如起始酶切A質(zhì)粒和B質(zhì)粒的量——3μL：7μL，已經(jīng)隱含了載體：插入片斷＝1：2~3的比例（PCR克隆經(jīng)折算后大概是1：5~10）。即使加上DNA回收中會損失、大片斷和小片斷回收效率不同、酶切質(zhì)粒同酶切PCR效率不同等影響因素，最后回收在試管中的大小片斷比例仍然可以落在一個合適的范圍內(nèi)。
酶切使用的酶量，是經(jīng)過計算的?？梢员ＷC是采用3－5倍的量切割質(zhì)粒或PCR片斷，因此可以保證酶切反應(yīng)的效率。
連接反應(yīng)在4℃下可以達到最大的轉(zhuǎn)化率。實際上對于大多數(shù)粘端突出3堿基的酶切位點，18 ℃ 3小時已經(jīng)足夠。
Nucleic Acid Research上登載的感受態(tài)菌制備方法，可以得到效果很穩(wěn)定的感受態(tài)細胞。每微克DNA可獲得10的八次方個轉(zhuǎn)化子。
因此，這套方法考慮到了克隆的每個重要環(huán)節(jié)，并以可靠的手段將這些環(huán)節(jié)“固定”下來。這套方法對于操作者和試劑帶來的波動也有很好的“容錯”能力，或者說，它的系統(tǒng)冗余比較大，保證了這套方法極高的成功率
