西亞試劑：：PCR產(chǎn)物克隆方法

通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效 率效低。因?yàn)門(mén)aqDNA聚合酶具有非模板依賴(lài)性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能 在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為 3'突出一個(gè)堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR 產(chǎn)物的效率通過(guò)較高，。在采用大量T4DNA連接酶并配以5—10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。對(duì)于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19 的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，?？傻玫阶懔恐亟M 子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法 克隆PCR產(chǎn)物。
粘端連接
　　引物中設(shè)計(jì)入限制酶位點(diǎn)：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互補(bǔ)堿基，因此可以在兩引物的5'末端設(shè)計(jì)單限制酶或雙限制酶切 位點(diǎn)。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互 補(bǔ)粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當(dāng)兩引物中設(shè)計(jì) 不同酶切位點(diǎn)時(shí)，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點(diǎn)是需要加長(zhǎng) PCR引物，除限制酶識(shí)別序列外，還需要在其5'端多合成3—4個(gè)堿基 以利于限制性?xún)?nèi)切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結(jié)合。即使如此，其酶切 效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變 PCR方法可克服上述缺點(diǎn)。該方法是通過(guò)在兩PCR引物序列中改變1至 數(shù)個(gè)核苷酸創(chuàng)造出一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。鑒于PCR引物的3'末端序 列的互補(bǔ)性是PCR成功的關(guān)鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個(gè)或 幾個(gè)堿基對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的 長(zhǎng)度，而且酶切效果優(yōu)于5'加端法。對(duì)于特定DNA片段的克隆，此方 法較為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。但對(duì)于基因診斷PCR產(chǎn)物的克隆，似乎5'加端法 更為適宜。
T4DNA聚合回切產(chǎn)生粘端
　　如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在 其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在dATP和dTTP 存在的情況下，用T4DNA聚合酶進(jìn)行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產(chǎn)生AccI和XmaI粘性末端（圖1）。 此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開(kāi)的載體進(jìn)行連接。這種方法只需 在PCR引物的5'端加2—4個(gè)堿基，但其可選擇的限制酶類(lèi)有限。
T－vector法
　　TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個(gè)堿 基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3'端突出一個(gè) 胸苷的質(zhì)粒DNA來(lái)克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出 100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個(gè)3'末端各加一處胸 苷。因?yàn)樵?種dNTP都存在時(shí)，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當(dāng)僅 一種dNTP存在時(shí)，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時(shí)， 用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉(zhuǎn)變成3'末端突出一個(gè)胸苷的T尾 載體，稱(chēng)為T(mén)－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆 PCR產(chǎn)物。Hotton等人也報(bào)道了另一種制備T－vector的方法。他們 使用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個(gè) 胸苷。由于末端轉(zhuǎn)移酶可以催化多個(gè)堿基（ddTTP）作為底物，使平 端載體DNA分子的兩個(gè)3'末端各加上一個(gè)T。用這種方法制備的T－vector 的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產(chǎn)物的5'末端連接，僅 5'末端可與PCR產(chǎn)物的3'末端形成磷酸二脂鍵。
　　共環(huán)消解法：最近，Jung等人報(bào)道了一種有效的PCR產(chǎn)物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，先用T4DNA連接酶催化 連接反應(yīng)，使5'端帶有限制酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增DNA片段連接成共環(huán)結(jié) 構(gòu)。然后再用相應(yīng)的限制酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生粘端DNA片段。對(duì)于對(duì)稱(chēng) 性限制酶位點(diǎn)，只需在引蛾的5'末端加上一關(guān)識(shí)別序列，因?yàn)樵诖?接成共環(huán)后能恢復(fù)限制酶切位點(diǎn)難于切開(kāi)的缺點(diǎn)，且可用于雙限制 酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，只不過(guò)有PCR產(chǎn)物共環(huán)化后，僅約1/4的限制酶切 點(diǎn)得以恢復(fù)。故此法較適用于單限制酶位點(diǎn)的克隆。
無(wú)連接酶亞克隆法(A)
　　無(wú)連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5’ 末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點(diǎn)，而是與某一質(zhì)粒兩 端分別互補(bǔ)的堿基。兩引物的3’端約20—25個(gè)核苷酸分別與待擴(kuò)增 DNA兩翼互補(bǔ)，5’端各有約24個(gè)核苷酸分別與線性化質(zhì)粒的3’端相 同的附加序列。由于線性化質(zhì)粒的3’端序列各不相同，PCR片段可 以通過(guò)選擇各引物的合適5’附加序列與引物3’端定向雜交。
　　由此物a和b產(chǎn)生的兩端有附加序列的PCR產(chǎn)物與未反應(yīng)引物分離后， 分別加入兩只含有線性化質(zhì)粒的反應(yīng)管中進(jìn)行第二次PCR。第1管中 用引物a和c，引物a即為第一PCR擴(kuò)增的上游引物a，引物c為下游引 物，與緊鄰5’端附加序列內(nèi)測(cè)的質(zhì)粒（+）鏈互補(bǔ)。同樣，第2管的 引物為b和d，引物b與第一次PCR擴(kuò)增的下游引物b相同，引物d為上 游引物，與緊鄰5’附加序列內(nèi)側(cè)的質(zhì)粒（-）鏈互補(bǔ)。
　　第二次PCR的第一循環(huán)中，PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒均變性與復(fù)性。除自身復(fù) 性產(chǎn)物（這種復(fù)性產(chǎn)物不被擴(kuò)增）外，PCR產(chǎn)物與質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)各自3’ 端互補(bǔ)序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時(shí)，重疊的3’端互為此物沿 各自互補(bǔ)鏈延伸，結(jié)果可產(chǎn)生PCR片段與線性質(zhì)粒的“連接”。然后 兩管中PCR擴(kuò)增各進(jìn)行15—20個(gè)循環(huán)。這便可產(chǎn)生大量一端管1）或 另一端連接有PCR插入片段的質(zhì)粒。
　　第二次PCR后，將第1管與第2管反應(yīng)液混合，用堿變性雙鏈，中和后 稀釋變性的DNA。反應(yīng)管中的單鏈DNA可以復(fù)性或幾種不同的產(chǎn)物， 除各自本身復(fù)性產(chǎn)物外，管1產(chǎn)物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異 源雙鏈DNA，并各自有一較長(zhǎng)的5’或3’懸端，這種長(zhǎng)的5’或3’懸 端相互互補(bǔ)，在低DNA濃度時(shí)可復(fù)性產(chǎn)生環(huán)化DNA。
　　盡管這種環(huán)化的DNA有兩個(gè)缺口，但它們可以直接用來(lái)轉(zhuǎn)化受體大腸 直桿菌。一旦進(jìn)入體內(nèi)，兩個(gè)缺口便共價(jià)連接，修復(fù)的質(zhì)粒即可復(fù) 制，下面以從λ噬菌體DNA中擴(kuò)增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體 中為例說(shuō)明LFS法。
　　這種方法同樣適于復(fù)雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一 次PCR時(shí)兩引物的5’附加序列不應(yīng)太短以免影響第二次PCR時(shí)異源雙 鏈的形成，以24個(gè)核苷酸較為合適。擴(kuò)增時(shí)若形成，引物二聚體， 一定要去除，否則會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化率。用LFS法已成功地克隆了長(zhǎng)達(dá) 1.7kb的基因片段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：①可用于常規(guī)方法無(wú)法進(jìn)行 亞克隆的片段；②適于任何PCR產(chǎn)物和任何質(zhì)粒；③可亞克隆特殊目 的（如含點(diǎn)突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對(duì)已構(gòu) 建了啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等序列的載體，可使待表達(dá)片段插入定向合適 位置；⑤較快，可在1d內(nèi)完成，較常規(guī)方法可靠，不需DNA連接酶。
　　DNA克隆是分子生物學(xué)的重要內(nèi)容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合 適限制酶切點(diǎn)而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采 用PCR技術(shù)行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時(shí)間，比之全基因合成更為經(jīng)濟(jì)和方便，因而愈來(lái)愈受重視。用PCR方法進(jìn)行傳染性 疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產(chǎn)物的異性問(wèn)題和分型問(wèn)題，采用 產(chǎn)物克隆和測(cè)序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準(zhǔn)確。隨著 PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，新的PCR產(chǎn)物的克隆方法也將不斷出現(xiàn)。

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