西亞試劑：：單克隆抗體技術(shù)

單克隆抗體的概念和原理

　　免疫反應(yīng)是人類對疾病具有抵抗力的重要因素。當(dāng)動(dòng)物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體?？贵w的特異性取決于抗原分子的決定簇，各種抗原分子具有很多抗原決定簇，因此，免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體實(shí)為多種抗體的混合物。用這種傳統(tǒng)方法制備抗體效率低、產(chǎn)量有限，且動(dòng)物抗體注入人體可產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。此外，要把這些不同的抗體分開也極困難。近年，單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，是免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破。

　?。?）單克隆抗體的基本概念 抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成。每個(gè)B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成該細(xì)胞的子孫，即克隆由許多個(gè)被激活B細(xì)胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

　?。?）單克隆抗體技術(shù)的基本原理 要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。其制備原理示意如下：

單克隆抗體制備示意圖

二、基本方法

　　抗原提純與動(dòng)物免疫
　　對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細(xì)胞抗原，可取1×107個(gè)細(xì)胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動(dòng)物免疫。
　　選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，雌雄不限。為避免小鼠反應(yīng)而不佳或免疫過程中死亡，可同時(shí)免疫3～4只小鼠。
　　免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動(dòng)物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價(jià)抗體為最終目的。免疫間隔一般2～3周。一般被免疫動(dòng)物的血清抗體效價(jià)越高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價(jià)特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價(jià)和親和力密切相關(guān)。末次免疫后3～4天，分離脾細(xì)胞融合。
　　骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
　　選擇瘤細(xì)胞株的最重要的一點(diǎn)是與待融合的B細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞，各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株。該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，此外，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的最高生長刻度為9×105/ml，倍增時(shí)間通常為10～15h。融合細(xì)胞應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞（活性應(yīng)大于95％）。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2105/ml，次日一般即為對數(shù)生長期細(xì)胞。
　　在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí)，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì)胞，其中在巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞。亦有用小鼠的脾細(xì)胞、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。
　　在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，切忌針頭刺破動(dòng)物的消化器官，否則所獲細(xì)胞會(huì)有嚴(yán)重污染。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至1×105/ml，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng)。
　　細(xì)胞融合
　　細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。其后吧培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有幾個(gè)問題應(yīng)特別注意。①細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。②反應(yīng)時(shí)間：在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分：對融合細(xì)胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時(shí)核查培養(yǎng)基情況。
　　有限稀釋法
　　篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能待續(xù)存活一周以上。融合細(xì)胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/孔），按Poisson法計(jì)算，應(yīng)有36％的孔為1個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0％～20％孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，爾后進(jìn)行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。
　　單克隆抗體的制備和凍存
　　篩選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時(shí)甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)，一般為5×105/鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當(dāng)增減。

　選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細(xì)胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細(xì)胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應(yīng)用的凍存保護(hù)劑。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50％～95％之間。如果低于50％，則說明凍存復(fù)蘇過程有問題。
　　單克隆抗體的純化
單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體（最常用Sepharose）交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達(dá)90％以上。蛋白可與IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合，同時(shí)還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時(shí)，1.44（吸光單位）相當(dāng)于1mg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對保持純化抗體的活性至關(guān)重要。

三、操作流程
（一）脾細(xì)胞
1．材料
(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。
(2) 1640培養(yǎng)液
(3) 2.5％FCS－1640營養(yǎng)液
2．操作方法
(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠。
(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。
(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。
(5) 直立小試管3min，使大塊的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸液移入離心管中。
(6) 以2.5％FCS—1640充滿離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時(shí)應(yīng)開始制備骨髓細(xì)胞）。
(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。
(8) 重復(fù)⑹、⑺步驟。
(9) 計(jì)算細(xì)胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。
（二）骨髓瘤細(xì)胞
骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。
選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,最好106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長速度快，繁殖時(shí)間短。
目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡稱SP2）；③P2—X？ ­—Ag8·6·5·3（簡稱653）；④FO
以653最為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來的一種漿細(xì)胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經(jīng)過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。
骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。
由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮鳥嘌呤。取約1×107～6×107對數(shù)生長期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細(xì)胞，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計(jì)數(shù)。
（三）飼養(yǎng)細(xì)胞
在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長繁殖，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長繁殖成群體，因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（經(jīng)10磅30min高壓滅菌）。
2．操作方法
（1）拉頸處死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔。
（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。
（5）1 000r／min離心10min。
（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬個(gè)活細(xì)胞。
（7）以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。
（四）融合細(xì)胞
1.融合劑
  細(xì)胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學(xué)融合法和生物融合法，如仙臺病毒，此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法。
  聚乙二醇（PEG），在分子量為200～700時(shí)，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1 000時(shí)，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑，對熱穩(wěn)定，與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4 000者，常用濃度為50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3調(diào)整），分子量小的PEG，融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50％濃度，pH偏堿時(shí)融合效應(yīng)最高。
也有采用30%～50％濃度的PEG加上10％二甲亞砜。
  不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時(shí)必須注意。每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)后方可應(yīng)用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。
2.融合過程
  融合的方法很多，常用的有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法。
  融合時(shí)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。
  1>．試劑與材料
  (1) 供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞。
  (2) 1640培養(yǎng)液100ml。
  (3) 完全1640液100ml。
  (4) 2.5％FCS－1640液50ml。
  (5) HAT培養(yǎng)液100ml。
  (6) 50％PEG：取分子量4 000，高純度的（日本進(jìn)口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌，使用前用預(yù)熱于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚紅檢查pH，一般不必調(diào)pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調(diào)整。
  (7) 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。
  (8) 40孔塑料培養(yǎng)盤。
  2>．操作方法
  ⑴ 準(zhǔn)備好脾細(xì)胞。
  ⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾細(xì)胞和107小鼠骨髓瘤細(xì)胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。
  ⑶ 室溫400g離心3min，使細(xì)胞沉淀。
  ⑷ 移去上清液。
  ⑸ 輕敲管底部，使沉淀流動(dòng)，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達(dá)融合溫度。
  ⑹ 加預(yù)熱至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn)，滴加過程要求持續(xù)2min。
  ⑺ 加1ml1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)1min。
  ⑻ 重復(fù)⑺一次。
  ⑼ 加1ml 1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)0.5min。
  ⑽ 重復(fù)⑼一次。
  ⑾ 加1640液15ml。
  ⑿ 室溫，400g離心1min，使細(xì)胞沉淀。
  ⒀ 去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
  ⒁ 往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細(xì)胞液，每孔1滴（約0.05ml）。  
  ⒂ 輕搖后，放入5％CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
  ⒃ 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。
  ⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長出來。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在10~20天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在1個(gè)月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。
  ⒅ 對繼續(xù)生長的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同時(shí)保存于液氮和進(jìn)行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失。
3.細(xì)胞融合的關(guān)鍵
  1>．技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。
  ２>．融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)。

四、雜交瘤細(xì)胞的保存
  （一）保存
當(dāng)獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后，必須將一部分雜交瘤細(xì)胞保存，否則在連續(xù)傳代的過程中，可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產(chǎn)生抗體的特性。另外在長期的培養(yǎng)過程中，難免不發(fā)生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。保存方法如下：
1．材料
(1) 細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞。
(2) 10％二甲基亞砜保護(hù)液（二甲基亞砜能損壞濾器，而又被高壓所破壞，所以不能過濾或高壓消毒。其本身就是毒品，無菌）：含10％二甲基亞砜、20％滅活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3) 20％FCS—1640培養(yǎng)液：含青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml。
(4) 滅菌的2ml安瓶等
2．操作方法
(1) 去掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液，加入10％FCS—1640液，使細(xì)胞懸浮。
(2) 1 000r/min離心10min，去上清。細(xì)胞沉淀用10％二甲基亞砜保護(hù)液制成懸液，使成1.0×107細(xì)胞／ml。
(3) 取樣，臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，應(yīng)在95％以上。
(4) 用注射器將細(xì)胞分裝安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。
(5) 放4℃ 2h。
(6) 放液氮罐氣態(tài)部分（-70℃）15h。
(7) 轉(zhuǎn)入液氮部分。
（二）復(fù)蘇
1．從液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2．無菌操作打開安瓶，取出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)瓶。
3．逐滴緩慢加入20％FCS－1640培養(yǎng)液3.5ml，這個(gè)過程延續(xù)3min。
4．5％CO2飽和濕度，37℃培養(yǎng)。
5．4h后棄去培養(yǎng)液上清，加入新鮮的20％FCS－1640培養(yǎng)液。
6．繼續(xù)培養(yǎng)，換液，以至形成單層。

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛