西亞試劑：：淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)

1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學與生物學基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。
　制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。

一、細胞融合前準備
(一)　免疫方案
　選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據(jù)抗原的特性不同而定。
　1.顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:
　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)
　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后
　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip
　　　　　　　　　　　　↓　3周后
　　　　　　　　　　加強免疫(融合前三天)　1×10７／0.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)
　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　取脾融合
　2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐劑皮下多點注射
　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml／點)
　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　第二次免疫　劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip
　　　　　　　　│　　　　　　　(ip劑量不宜超過0.5ml)
　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　　第三次免疫　劑量同上，不加佐劑，ip
　　　　　　　　│ (5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果)
　　　　　　　　↓2～3周后
　　　　　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
　　　　　　　　↓3天后
　　　　　　　取脾融合
　　目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪娏丝乖拿庖咴?，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反應性。

(二)　飼養(yǎng)細胞
　　在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復蘇。
　　　　　小鼠腹腔巨噬細胞的制備
　　　　　小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周齡
　　　　　　↓
　　　　　拉頸處死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分鐘
　　　　　　↓
　　　　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
　　　　　　↓
　　　　　用無菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液
　　　　　　↓
　　　　　反復沖洗，吸出沖洗液
　　　　　　↓
　　　　　放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)／分離心5～6分鐘
　　　　　　↓
　　　　　用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)1×10５／ml
　　　　　　↓
　　　　　加入96孔板，100μl／孔
　　　　　　↓
　　　　　放入37℃　CO2孵箱培養(yǎng)
　　一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞時，細胞濃度為5×106／ml，小鼠脾細胞為1×106／ml，小鼠的成纖維細胞(3T3)1×105／ml，均為100μl／孔。

(三)　骨髓瘤細胞
　　骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量　McAb。
　　常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
　　骨髓瘤細胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細胞的最大密度不得超10６／ml，一般擴大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細胞的倍增時間為16～20小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。
　　一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變。
　　保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95％，也是決定細胞融合的關(guān)鍵。

(四)　免疫脾細胞
　　免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞

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