西亞試劑：：克隆技術(shù)

實(shí)驗(yàn)題目：目的基因的亞克隆
教 師：XXX  
實(shí)驗(yàn)類型：綜合
學(xué)　　時(shí)：10(參考)
內(nèi)　　容：
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、掌握細(xì)菌基因組提取的方法和原理。
2、掌握限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組及其結(jié)果分析。
3、掌握基因片段回收的方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌基因組的提取：通過(guò)堿法或者酶法裂解細(xì)菌之后，可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來(lái)。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于0.14mol/L的NaCl，而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中，通過(guò)溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開(kāi)。氯仿－異戊醇法除去蛋白，2倍體積乙醇將DNA沉淀出來(lái)。
限制性核酸內(nèi)切酶只作用于特定的位點(diǎn)，處理基因組后只會(huì)得到有限的片斷。通過(guò)單酶切或者多酶切后電泳檢驗(yàn)就可以得到與物種本身有關(guān)的特定的圖譜。
電泳后選定目的基因的條帶，紫外燈下將含有目的基因的凝膠切下，使用凝膠回收試劑盒，將凝膠溶化后，通過(guò)吸附柱時(shí)，核酸片段就吸附在柱上，洗脫液洗脫后加入2倍體積乙醇，核酸沉淀，TE溶解沉淀，核酸片段得到回收。
三、試劑與器材
1、試劑 E.coli JM109，牛肉膏，胰蛋白胨，NaCl，微量細(xì)菌基因組抽提試劑盒（上海生工），BamH I、Xho1 核酸內(nèi)切酶（Takara），NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder)，凝膠電泳回收試劑盒
2、器材 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，水平電泳儀，漩渦混合儀，紫外檢測(cè)儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，微量移液器及吸頭。
四、操作方法
1．使用LB培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)菌體。
2．離心收集菌體，根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取基因組。
3．限制性酶處理基因組。
4．E.coli JM109的基因組經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶處理后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)將酶切圖譜采集下來(lái)并對(duì)其分析。
5．紫外燈下將需要回收的核酸片段切下來(lái)，使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。
6．電泳檢測(cè)回收的核酸片段。
五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)
1．菌體培養(yǎng)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌，染菌后提取得到的基因組會(huì)成多條帶，酶切的圖譜也會(huì)比較復(fù)雜。
2．基因組提取過(guò)程中所使用的器材要嚴(yán)格滅菌，防止核酸酶降解基因組。
3．基因組提取過(guò)程不可以劇烈振蕩，防止DNA斷鏈。
4．在內(nèi)切酶最適條件下充分處理基因組，得到正確的圖譜。
5．瓊脂糖溶化要充分。
6．切下凝膠時(shí)要注意防護(hù)紫外線，電泳結(jié)束之后盡快將膠條切下來(lái)，凝膠條要窄，脫尾部分不回收。
六、思考題
1．BamH I、Xho1的作用位點(diǎn)分別是什么？
2．內(nèi)切酶分析基因圖譜的注意事項(xiàng)？
3．瓊脂糖溶解不好會(huì)對(duì)核酸片段回收產(chǎn)生什么影響？
4．凝膠回收的注意事項(xiàng)？

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