西亞試劑：：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

 
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析 　　凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種. 一、瓊脂糖凝膠電泳: 　　瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和 鑒定核酸的方法.瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物.根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度， 把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖.低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為62～65℃，溶解后在 37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連 接等. (一)凝膠濃度 　　凝膠濃度的選擇依DNA分子的大小而定.
瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍

瓊脂糖濃度(%)
線型DNA分子的分離范圍(Kb)
0.3
5～60
0.6
1～20
0.7
0.8～10
0.9
0.5～7
1.2
0.9～6
1.5
0.2～3
12.0
0.1～2
(二)電泳緩沖液 　　核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使 DNA沉淀.TAE緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合 二價(jià)陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解. 　　10XTBE緩沖液的配制 　　Tris鹼，108克 　　EDTA，9.3克 　　硼酸，55克 　　H2O至，1000ul 　　(其PH應(yīng)為8.0～8.2) 　　臨用時(shí)用水稀至0.5XTBE(20倍稀釋. (三)核酸電泳的指示劑與染色劑 　　1.指示劑:核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中 呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在 1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似. 　　指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用有①增加樣 品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi).②在電泳中形成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置.③使樣品呈色，使加樣操作更方便. 　　染色劑:核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其 次是銀染色. 　　溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對 之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光.根據(jù)情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為 0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂 糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當(dāng)溴化乙錠太多，凝膠染 色過深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察. 　　銀染色:銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛 使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色. 也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收. (四)電泳 　　1.電泳裝置: 　　電泳裝置主要有電泳儀，電泳槽及灌膠模具等. 　　2.電泳方法: 　　(1)用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈.放在水平桌面上，并架好梳子. 　　(2)根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%濃度的瓊脂糖用于電泳. 　　3.配制0.5XTBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋 或微波爐內(nèi)加熱熔化.冷卻至60℃(需要時(shí)可加入溴乙錠)，倒入電泳槽中，待凝固. 　　4.向電泳槽中倒入0.5XTBE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子.如樣品孔內(nèi)有 氣泡，應(yīng)設(shè)法除去. 　　5.在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi). 　　6.接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(靠近加樣 孔的一端為負(fù)).電壓為1-5V/cm(長度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算). 　　7.根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳.一般200～400bp的PCR產(chǎn)物50V電壓， 電泳20～40min即可. 　　(3)溴化乙錠染色后，紫外儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴(kuò) 增產(chǎn)物的大小. 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 　　聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析.其裝載的樣品量大，回收DNA純度高.長度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分離. 　　聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和 過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲 雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠. 　　聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的 有效分離范圍見表2.
丙烯酰胺(%)
有效分離范圍(bp)
溴酚蘭*
二甲苯青*
3.5
100～2000
100
460
5.0
80～500
65
260
8.0
60～400
45
160
12.0
40～200
30
70
15.0
25～150
15
60
20.0
10～100
12
45
　　*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數(shù)目(bp). (一)材料 　　1.電泳儀器:電泳儀，垂直電泳槽及其附件. 　　2.30%丙烯酰胺 　　丙烯酰胺，29克 　　N，N'一亞甲基雙丙烯酰胺，1克 　　H2O，加至100ml 　　裝于棕色瓶內(nèi)，4℃可保存二個(gè)月. 　　3.10%過硫酸銨 　　過硫酰銨，1克 　　加水至，10ml 　　4℃可保存一周，-20℃可保存一個(gè)月. 　　4.1XTBE電泳緩沖液 　　5.TEMED(四甲基乙烯基二胺) (二)聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 　　根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠. 　　1.按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂 糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出. 　　2.將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角. 　　3.按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù). 　　4.加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液 體接近溢出時(shí)為止. 　　5.立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力 的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使 成10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會. 　　6.室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE 緩沖液. 　　7.小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，?子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn) 生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則. 　　8.將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不 要產(chǎn)生氣泡. 　　9.接好電極，電壓為1-8V/cm，進(jìn)行電泳. 　　10.根據(jù)指示劑遷移位置來判定是否終止電泳. 　　11.電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻 璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶 液中，15～30min后取出水洗紫外儀下觀察結(jié)果. 　　12.聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶.要求更高 的靈敏度，可用銀染

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛