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限制性內(nèi)切酶綜述(Restriction Endonucleases: An Overview)
30多年前，當(dāng)人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵，而這種"限制"病毒生存的辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。首批被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點(diǎn)切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。
當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在上世紀(jì)七十年代流傳開來的時候，以NEB為代表的許多公司開始尋找更多的限制性內(nèi)切酶。除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn)。人們正在從數(shù)以千計的細(xì)菌及古細(xì)菌中尋找新的限制性內(nèi)切酶。而對已測序的原核基因組數(shù)據(jù)分析表明，限制性內(nèi)切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的細(xì)菌和古細(xì)菌似乎都能編碼限制性內(nèi)切酶。
限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來說，它們可以小到如Pvu II（157個氨基酸），也可以比1250個氨基酸的Cje I更大。在已純化分類的3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識別序列。其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的。對具有未知特異識別序列的限制性內(nèi)切酶的研究發(fā)現(xiàn)工作仍在繼續(xù)。人們從分析細(xì)胞提取物的生化角度研究的同時，也采用計算機(jī)分析已知的基因組數(shù)據(jù)，以期有更多的發(fā)現(xiàn)。盡管很多新發(fā)現(xiàn)的酶的識別序列與已有的重復(fù)--即同裂酶，仍然有識別新位點(diǎn)的酶不斷被發(fā)現(xiàn)。
上世紀(jì)80年代，NEB開始克隆并表達(dá)限制性內(nèi)切酶?？寺〖夹g(shù)由于將限制性內(nèi)切酶的表達(dá)與原有細(xì)胞環(huán)境分離開來，避免了原細(xì)胞中其它內(nèi)切酶的污染，從而提高了酶的純度。此外，克隆技術(shù)提高了限制性內(nèi)切酶的產(chǎn)量，簡化了純化過程，使得生產(chǎn)成本顯著降低；克隆的基因很容易進(jìn)行測序分析，表達(dá)出的蛋白也能進(jìn)行X射線結(jié)晶分析，這使得我們對于克隆產(chǎn)物更加確定。
