7．3 植物總DNA 的提取
1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分離了植物DNA，然而這些DNA 是不能用于克隆的。在發(fā)明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人們可用分離動(dòng)物組織DNA 的方法分離植物DNA。去除植物帶電高分子污染物的方法有核分離（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）分離（Murray，Thompson 1980）和鹽酸／十二烷基肌氨酸鈉分離（Sung，Slightom 1981）等。在這些方法中，CTAB 方法因簡(jiǎn)便、快速而使用最廣泛。收集和保存植物組織的方法對(duì)于 DNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量也有很大影響。雖然已能成功地從植
物標(biāo)本和化石中分離出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鮮材料能產(chǎn)生最好的結(jié)果，特別是對(duì)于產(chǎn)生大量單寧、酚或其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的種。如材料不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)保存在冷而濕的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷凍保存。如果沒(méi)有條件，最好在無(wú)水CaSO４瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取應(yīng)盡快進(jìn)行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。
提取DNA 的過(guò)程中有許多因素能導(dǎo)致DNA 降解。首先是物理因素。因?yàn)镈NA 分子量較大，機(jī)械張力或高溫很容易使DNA 分子發(fā)生斷裂。因此，在實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)盡可能輕緩，盡量避免過(guò)多的溶液轉(zhuǎn)移及劇烈的振蕩等，以減少機(jī)械張力對(duì)DNA 的損傷，同時(shí)也應(yīng)避免過(guò)高的溫度。其次，細(xì)胞內(nèi)源DNA 酶及細(xì)胞破裂釋放的次級(jí)產(chǎn)物也會(huì)導(dǎo)致DNA 降解。所以在提取DNA 的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了許多可供選擇的分離緩沖液，以適應(yīng)不同的植物材料。分離緩沖液的pH 值有時(shí)需要進(jìn)行改進(jìn)，pH 應(yīng)避免接近降解酶的最適點(diǎn)。大多數(shù)降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最適點(diǎn)在 5．0～6．0 之間，而DNA 酶pH 值最適點(diǎn)在 7．0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在過(guò)酸的條件下，DNA 脫嘌呤會(huì)導(dǎo)致DNA 的不穩(wěn)定，極易在堿基脫落的地方發(fā)生斷裂，所以大多植物DNA 提取緩沖液的pH 值為8．0，有的甚至為9．0。緩沖液中包含了大量的復(fù)合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巰基乙醇、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇（DTT）、抗壞血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸鹽（DEPC）、溴化乙錠（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物質(zhì)有些是抑制內(nèi)切酶和非特異性核酸酶的，所以在其后的步驟中要將其除去。分離DNA 與蛋白質(zhì)一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿對(duì)蛋白質(zhì)均有極強(qiáng)的變性作用，而對(duì)DNA 無(wú)影響。下面的方法描述DNA 與污染物多糖的分離，也可用陰離子交換層析儀來(lái)進(jìn)行。下面列出了3 種常見(jiàn)的分離植物總DNA 的方法。3 種方法溶解細(xì)胞膜和分離蛋白質(zhì)的方法不同，各有其優(yōu)、缺點(diǎn)。
7．3．1 CTAB 緩沖液方法
這是最廣泛地用來(lái)分離植物DNA 的方法，對(duì)大多數(shù)植物種都適用，特別是當(dāng)樣本數(shù)量很小時(shí)。此法運(yùn)用陽(yáng)離子去污劑CTAB 溶解植物細(xì)胞膜，并與DNA 形成一復(fù)合物。其優(yōu)點(diǎn)是不需要準(zhǔn)備大量的植物組織，而且適合像葉、根、種子、胚、胚乳、花粉和懸浮培養(yǎng)的組織等多種類型的組織（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法對(duì)樣品數(shù)量的要求也不高，從小到毫克數(shù)量的標(biāo)本（木乃伊、化石）到許多克的新鮮材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。
7．3．l．1 CTAB 的實(shí)驗(yàn)方法
1．材料
（1）2 倍CTAB 緩沖液：
100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0
1．4mol／dm３NaCI
20 mmol／dm３EDTA
2％ CTAB（W／V）
1％ PVP-360（W／V）
0．2％ß-巰基乙醇（體積比，用前在通風(fēng)櫥中加）
（2）清洗緩沖液：
76％乙醇
10 mmol／dm３乙酸銨
（3）懸浮緩沖液：
10 mmol／dm３乙酸銨
0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8．
2．步驟
（1）加熱分離緩沖液、研缽、研杵到60℃。
（2）在熱研缽中放人0．5～1．5g 新鮮或冰凍的葉子，用7．5ml 2 倍CTAB 分離緩沖液研磨（可加些石英砂幫助研磨）。對(duì)凍干的組織用1 倍CTAB 緩沖液研磨。把研碎的組織倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 緩沖液沖洗研缽，將沖洗液加到管中。
（3）將試管在60℃下放置30～60 分鐘，然后輕輕振蕩，使之充分混合后降至室溫。
（4）在試管中加入10ml 氯仿－異戊醇（24:1）萃取液（如顏色深可再進(jìn)行一次），輕輕搖晃使其混合，在室溫下1500r／min 離心5 分鐘，使其分相。
（5）將上層的水相倒入－15ml 管中，加2／3 體積的冷異丙醇，輕輕混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
（6）室溫下 800r／min 離心 3～5 分鐘，如果看不到小團(tuán)或沉淀，可在－20℃下放置 20分鐘再離心。
（7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，這時(shí)的核酸一般松散地貼在管的底部，加 15ml清洗緩沖液，輕輕地旋轉(zhuǎn)清洗沉淀物，15～20 分鐘后核酸將變得更白。
（8）室溫下800r／min 離心5 分鐘（如不充分，則加大離心速度或延長(zhǎng)離心時(shí)間），倒掉清洗緩沖液，將管倒扣在紙巾上，讓沉淀物干燥，小心不要讓DNA 滑掉。
（9）按沉淀物的大小用少量懸浮緩沖液（10～100 μl）懸浮DNA。
（l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下溫育 30～60 分鐘。
（11）如果組織包含單寧或其他次級(jí)產(chǎn)物，可以對(duì) DNA 作進(jìn)一步純化（可用氯仿、苯酚純化）。一些材料可能需要用氯銫（CsCl）梯度純化。上述方法也可以進(jìn)行改進(jìn)，像巰基乙醇的濃度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗壞血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8.0，lmmol／dm３EDTA）作懸浮緩沖液。
7．3．l．2 CTAB 沉淀法
1．材料
2 倍CTAB 分離緩沖液；沉淀緩沖液：
100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。
2．步驟
（1）與7．3．1．1 中前4 個(gè)步驟同。
（2）吸取上層水相，將其例入一個(gè)15ml 管中。
（3）加 3 倍體積的沉淀緩沖液，使NaCI 的濃度減少到 0．35mol／dm３，室溫下放置 30分鐘。
（4）室溫下 2 000r／min 離心 5 分鐘，以沉淀 DNA。
（5）根據(jù)沉淀物的大小，用少量的懸浮緩沖液（10～100μl）懸浮DNA。
（6）雖然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是對(duì)那些包含單寧或其他次級(jí)產(chǎn)物的組織，可以在氯化銫梯度上進(jìn)一步純化。
7．3．2 蛋白質(zhì)沉淀方法
這個(gè)方法可以產(chǎn)生高質(zhì)量的DNA，但產(chǎn)量也是最低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸鉀沉
淀蛋白質(zhì)和多糖（Dellaporta 等1983；Galau 等1988；Hughes，Galau 1988）。此方法不需要有機(jī)提取，而且快速，所以對(duì)大量樣品比較合適。
1．材料
提取緩沖液：100mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值8．0；50mmol／dm３EDTA，pH 值8．0；500mmol／dm３ NaCl；2％SDS（w／v）；l％PVP-360（w／v）；0．1％β-巰基乙醇（體積比），用之前在通風(fēng)櫥中加。
2．步驟
（1）用液氮在研缽中研磨1．0g 新鮮葉子，可以加一些石英砂幫助研磨。將研磨完畢的粉末貯存在－80℃冰箱中，在加提取液之前，不要讓植物材料融化。
（2）在冰凍的組織中加 6ml 提取緩沖液，轉(zhuǎn)到一個(gè)15ml 的離心管中，充分振蕩大約30 秒鐘，使之混合均勻，然后在65℃下放置20 分鐘。
（3）往管中加入2ml 5mol／dm
３乙酸鉀（pH 值6．5），充分搖勻，在冰水中放置5 分鐘。隨著不溶的十二烷基硫酸鉀的沉淀，大部分蛋白質(zhì)和多糖作為復(fù)合物被除去了。
（4）在 4℃下 2 000r／min 離心 20 分鐘。
（5）吸出上清液，將其倒入一個(gè)干凈的 15ml 的離心管中，不要帶入顆粒物質(zhì)，然后加 4ml 異丙醇輕輕混合，在－20℃下放置。
（6）在4℃下 2 000r／min 離心 15 秒鐘，DNA 沉淀后，輕輕地倒掉上清液，在紙巾上倒扣10 分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，以干燥沉淀物。
（7）將沉淀物放在 100TE 中溶解，然后將溶液倒入一個(gè)1．sml 離心管中，離心 5分鐘，移去不溶的沉淀。
（8）將管中上清液倒入另一個(gè) 1．5ml 離心管中，加 75μl 3mol／dm３ NaAc（pH 值 7．6）和500μl 冷異丙醇，充分混合，在—20℃下放置1～2 小時(shí)，拿出后再在室溫下放10 秒鐘，使管中DNA 沉淀。
（9）用 500μl 80％乙醇洗沉淀物 10 分鐘，離心 1 分鐘，干燥沉淀物 10 分鐘。
（10）根據(jù)DNA 沉淀物的大小，用少量的 TE（10～100μl）溶解DNA。
7．3．3 氯化銫方法
這個(gè)方法的原理是根據(jù)在氯化銫（CsCl）中的不同密度梯度來(lái)分離細(xì)胞成分。此方法可以產(chǎn)生大量高純度的DNA，但費(fèi)時(shí)，而且需昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)需要復(fù)雜的有機(jī)提取或沉淀的材料比較適合（Carr，Griffith 1987；Weeks 等 1986）。在一些情況下，它可能是在含大量次級(jí)產(chǎn)物的植物中提取高質(zhì)量DNA 的唯一方法。DNA 可以在一個(gè)平衡的CsCl 梯度中通過(guò)與以下幾個(gè)染料中的一個(gè)結(jié)合而被純化， 這幾個(gè)染料為溴化乙錠（ Ethidium bromide）、Bisbenzimicle、碘化丙錠（propidium iodide）、Bisbenzimide，它們不同的浮力密度對(duì)分離不同的染色體組特別有用。
7．3．4 PCR 小量制備法
此方法的優(yōu)點(diǎn)是一次可以提純很多樣品，比較快速，而且小于10mg（50mm）的新鮮葉子材料就可以產(chǎn)生足夠的DNA，產(chǎn)生的DNA 對(duì)雜交實(shí)驗(yàn)是可用的（Millgan 1992）。這個(gè)方法存在的問(wèn)題是DNA 沉淀物可能不夠緊密，或不一定能形成一緊密的DNA 沉淀。
1. 材料
分離緩沖液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm
３NaCI；25 mmol／dm
３EDTA；
0．5 ％ SDS。
2．步驟
（1）用1．5ml 離心管研磨小的組織樣品。可取管口大小的新鮮葉子（＜10mg），凍在液氮中
的葉子也可用。
（2）在研碎的樣品中加 400μl 的分離緩沖液，用適合的速度渦旋 10 秒鐘，以分散開(kāi)樣品。
（3）在室溫下將1．5ml 離心管中樣品離心 12～15 分鐘，沉淀細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。
（4）搜集300μl 的上清液，棄去沉淀。
（5）在上清液中加300μl 預(yù)冷異丙醇，倒轉(zhuǎn)樣品1～3 次，使之充分混合，在室溫下至少放
置5 分鐘。
（6）將微離心管中的樣品在室溫下離心20 分鐘，以搜集沉淀的DNA。
（7）棄去上清液，用300μl 80％的乙醇室溫下沉淀 10 分鐘。
（8）室溫下離心樣品12 分鐘，棄去上清液。
（9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室溫下離心 5 分鐘，棄去上清液。
（10）室溫下干燥樣品1 小時(shí)或?qū)悠贩胚^(guò)夜。
（11）用 100μl TE 懸浮樣品。
丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛
