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碧云天生產(chǎn)的超級感受態(tài)細菌制備試劑盒(Supercompetent Cell Preparation Kit)是一種用于快速制備高轉(zhuǎn)化效率大腸桿菌 感受態(tài)細菌的試劑盒。超級感受態(tài)細菌制備試劑盒是在傳統(tǒng)超級感受態(tài)細菌制備方法的基礎(chǔ)上進行適當改良而成，操作便捷，轉(zhuǎn) 化效率高。
使用本試劑盒可以使感受態(tài)效率達到108-109 cfu/μg質(zhì)粒。對于小的質(zhì)粒效率略高，而對于大的質(zhì)粒則效率略低一些。用本試 劑盒制備的超級感受態(tài)細菌不僅可以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，而且非常適合于轉(zhuǎn)化普通的連接產(chǎn)物，特別適合于轉(zhuǎn)化平端連接等需要高轉(zhuǎn)化效 率的情況 。
使用本試劑盒操作簡單，細菌培養(yǎng)好后僅需60分鐘左右即可完成超級感受態(tài)細菌的制備。
本試劑盒適用于絕大部分常見的大腸桿菌，包括DH5α、JM109、TG1、HB101和XL-1等。對于一些用于蛋白表達或病毒質(zhì)粒構(gòu)建 的特殊大腸桿菌也適用，制備出來的感受態(tài)菌轉(zhuǎn)化質(zhì)?？隙]有問題，但如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物有時效果不如DH5α等其它常見的細 菌。
本試劑盒提供了專門用于制備超級感受態(tài)的特殊細菌培養(yǎng)液，可以提高制備出來的感受態(tài)菌的轉(zhuǎn)化效率，同時也方便了用戶，不 必自行配置相應(yīng)的培養(yǎng)液。
本試劑盒可以分多次使用，共可以制備足夠進行100次轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細菌。
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保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項：
在制備感受態(tài)細菌的過程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受態(tài)菌的過程中熱休克后的37℃培養(yǎng)時也必須使用無抗生素的LB， 即便轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒是有抗性的。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 涂平板： 為取得最佳的感受態(tài)效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板，并培養(yǎng)過夜。
2. 接種： 取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的LB平板，后續(xù)操作均在超凈臺內(nèi)進行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下， 使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或 牙簽放到裝有3毫升LB的細菌培養(yǎng)試管內(nèi)。上述操作也可以使用接種環(huán)等進行操作。
3. 培養(yǎng)： 37℃約200rpm培養(yǎng)過夜，通常培養(yǎng)時間控制在16小時左右為宜。絕對不宜超過18小時。
4. 再接種培養(yǎng)： 根據(jù)需要制備的超級感受態(tài)細菌的量，按照1:500的比例用新鮮培養(yǎng)的過夜菌接種培養(yǎng)。例如取100微升的新鮮過夜菌到50毫升本 試劑盒提供的超級感受態(tài)細菌培養(yǎng)液中，37℃約200rpm培養(yǎng)。通常在大約培養(yǎng)2.5-3.5小時后OD600可以達到0.6-0.7。
5. 制備感受態(tài)細菌：
(1) 在培養(yǎng)的細菌OD600達到0.6-0.7時，把培養(yǎng)的菌液置于冰浴中，冷卻15分鐘。注意：后續(xù)所有操作均須在4度或冰浴進行。
(2) 4℃ 4000g離心5分鐘收集細菌，棄上清。 注意：離心機必須預(yù)先冷卻。
(3) 如果離心沉淀前的菌量為50毫升，按后續(xù)操作進行，如果是其它體積則按比例換算后進行后續(xù)操作。
(4) 用20毫升預(yù)冷的超級感受態(tài)制備試劑A輕輕重懸細菌沉淀。懸浮時一定要很輕很慢，否則會影響效果。
(5) 冰浴15分鐘。
(6) 4℃ 4000g離心5分鐘收集細菌，棄上清。 注意：離心機必須預(yù)先冷卻。
(7) 用2毫升預(yù)冷的超級感受態(tài)制備試劑B輕輕重懸細菌沉淀。懸浮時一定要很輕很慢，否則會影響效果。
(8) 冰浴15分鐘。
(9) 在冰浴上進行分裝，可以根據(jù)需要適當分裝成50-200微升/管。
(10) 立即使用或用液氮或乙醇干冰浴速凍后-70℃保存。通常6個月內(nèi)效率不會有明顯的變化。
6. 感受態(tài)細菌的使用：
(1) 對于感受態(tài)細菌效率的測定或連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(其它如基因突變產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化等參考連接產(chǎn)物進行) ：
a) 在冰上緩慢融解感受態(tài)細菌(對于新鮮制備的感受態(tài)就可以直接使用了)，如果檢測感受態(tài)細菌的效率，加入10pg-1ng質(zhì) 粒，但質(zhì)粒的體積不宜超過感受態(tài)細菌量的10%。如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，每50微升感受態(tài)細菌加入2-10微升連接產(chǎn)物。
b) 輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物。冰浴或冰水浴放置30分鐘。
c) 42℃水浴，熱休克2分鐘。
d) 熱休克后立即置于冰水浴中，2分鐘。
e) 加入900微升LB，37℃200rpm培養(yǎng)1小時。
f) 如果檢測感受態(tài)效率，取100微升涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB平板上。如果轉(zhuǎn)化的是連接產(chǎn)物，2000-3000g離心1分鐘或更 長時間使細菌充分沉淀下來。去除約900-950微升LB培養(yǎng)液。細菌沉淀用余下的LB培養(yǎng)液重懸，然后全部涂布到含有適當抗生素的LB平板上。37℃培養(yǎng)過夜。
(2) 對于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：
a) 融解感受態(tài)細菌，加入不少于50ng質(zhì)粒到30-50微升感受態(tài)細菌中。質(zhì)粒的量可以是1微克或更多，但體積不宜超過感受態(tài) 細菌量的10%。
b) 輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和質(zhì)粒。冰浴或冰水浴放置10分鐘。
c) 取全部菌液直接涂布到含有適當抗生素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜
