西亞試劑：：Pyrosequencing技術(shù)及其在DNA測序和SNP研究中的應(yīng)用

的應(yīng)用

        DNA序列分析技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，而雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技術(shù)。在基于Sanger法的全自動DNA測序技術(shù)中，測序反應(yīng)產(chǎn)生的DNA片段是熒光標記的，這些片段經(jīng)過平板膠電泳或毛細管電泳得到分離，熒光分子被激發(fā)而發(fā)光，發(fā)出的光信號被檢測系統(tǒng)檢測。Sanger法的優(yōu)勢在于可以分析未知DNA的序列，且單向反應(yīng)的讀序能力較長，目前的技術(shù)可以達到1000bp以上。

        在實際工作中，很多情況需要對已知序列的DNA片段進行序列驗證，而這種分析往往測幾十bp就可以滿足需要.在這種情況下，Sanger法未必是最合適的ＤＮＡ序列分析技術(shù)。新發(fā)展的Pyrosequencing(焦磷酸測序)技術(shù)應(yīng)該是目前最適合這些應(yīng)用的ＤＮＡ序列分析技術(shù)。

    Pyrosequencing技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)對DNA的序列分析無須進行電泳，DNA片段無須熒光標記，因此相應(yīng)的儀器系統(tǒng)無須熒光分子的激發(fā)和檢測裝置.本文將就Pyrosequencing技術(shù)的原理和應(yīng)用進行介紹和討論．

一、Pyrosequencing技術(shù)的原理
 
    首先通過PCR制備待測序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素標記的。PCR產(chǎn)物和偶連avidin的Sepharose微珠孵育，DNA雙鏈經(jīng)堿變性分開；純化得到含生物素標記引物的待測序單鏈，并和測序引物結(jié)合成雜交體。

    Pyrosequencing技術(shù)是由四種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級連反應(yīng)，四種酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase).反應(yīng)底物為adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、熒光素(luciferin)。反應(yīng)體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。反應(yīng)體系配置好后就可以加入底物dNTP進行序列分析了。

    測序反應(yīng)是這樣進行的：在每一輪測序反應(yīng)中，只能加入四種dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如該dNTP與模扳配對，聚合酶就可以催化該dNTP摻入到引物鏈中并釋放焦磷酸基團（PPi）。摻入的dNTP和釋放的焦磷酸是等摩爾數(shù)目的.注意：反應(yīng)時deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因為DNA聚合酶對dATP S的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATP S不是熒光素酶的底物。

    硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩爾數(shù)目是一致的。ATP驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素(oxyluciferin)的轉(zhuǎn)化，氧化熒光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測并由pyrogram™反應(yīng)為峰。每個峰的高度(光信號)與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應(yīng)體系。然后就可以加入下一種dNTP。 Pyrosequencing技術(shù)的原理： 隨著以上過程的循環(huán)進行，互補DNA鏈合成，DNA序列由Pyrogram的信號峰確定。

    商品化的Pyrosequncing試劑盒通過以下幾點來保證反應(yīng)的有效進行:底物濃度已最佳化，高質(zhì)量的三磷酸腺苷雙磷酸酶保證了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPαS；dNTP降解速率慢于摻入速率，有利于dNTP充分摻入；ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP濃度和光產(chǎn)生正比于摻入的dNTP數(shù)目。

    有必要指出的是:Pyrosequencing技術(shù)可以確定一個模板的20-30bp的序列。有的研究者經(jīng)過改進而使該技術(shù)的讀序長度增加一倍以上[1]。

    為了增加信噪比，在Pyrosequencing技術(shù)中，用dATPαS取代dATP，因為dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效利用，也更有利于閱讀富含T的區(qū)域，且dATPαS不是熒光素酶的底物。但dATPαS是兩種異構(gòu)體SpdATPαS和RpdATPαS的混合物，聚合酶只能利用SpdATPαS。因此，為了得到最佳反應(yīng)效率，必需使反應(yīng)體系中保持最佳濃度的SpdATPαS，但同時增加了相應(yīng)濃度的無用的RpdATPαS。dATPαS被雙磷酸酶降解后的產(chǎn)物是雙磷酸酶的抑制劑，所以隨著反應(yīng)進行，被雙磷酸酶降解的dATPαS的降解產(chǎn)物濃度越來越大，雙磷酸酶的活性越來越低。這可能是Pyrosequencing技術(shù)測序長度很短（20-30bp）的主要原因之一。新的革新就在于在反應(yīng)體系中只加入SpdATPαS，這樣一來可以大大降低dATPαS降解產(chǎn)物的濃度，維持雙磷酸酶較長時間的活性。目前這個革新可以使Pyrosequencing技術(shù)的測序長度增加最少一倍，達到50至上百bp。

二， Pyrosequencing技術(shù)在DNA測序和SNP研究中的應(yīng)用:
    Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技術(shù)，因此該技術(shù)的第一個應(yīng)用是DNA序列分析，基于該技術(shù)的分析系統(tǒng)配合相應(yīng)軟件還可以進行基于DNA序列分析的已知SNP的分析和SNP頻率確定。

    Pyrosequencing技術(shù)對DNA片段的序列分析的讀序長度有限，但這并不影響其在生命科學(xué)研究中的價值.我們知道，在很多場合中，我們對DNA序列分析的要求是讀序越長越好，比如諸如人類基因組計劃的工作，而在很多場合中，讀序長度并不是主要指標，讀序精確和能說明問題是主要指標，比如分子臨床診斷領(lǐng)域，對細菌和其他病原微生物的分子診斷，只需對最能代表該微生物的DNA片段進行分析即可，最能代表該微生物的DNA片段往往也就十幾到幾十bp。可以提供序列資料的分子診斷是分子診斷的黃金標準，其權(quán)威性比其他DNA分析方法如NORTHERN，基因芯片和定量RT-PCR技術(shù)更好。

    SNP研究大致分為兩個部分，一是SNP數(shù)據(jù)庫的建立，二是SNP功能的研究。一種生物的所有SNP的數(shù)據(jù)庫的建立是一件很大的工程，可以承擔(dān)該工作的是那些具有大規(guī)?；蚪M測序能力的研究單位，而且數(shù)據(jù)庫的建立很大程度上依賴Sanger法測序。但眾所周知，如果不研究每個SNP的功能，數(shù)據(jù)庫的建立即SNP的發(fā)現(xiàn)就沒有多大意義。對已發(fā)現(xiàn)的SNP的功能的研究，有兩個工作是必須的，一是SNP頻率分析，一是SNP位點的堿基種類的證實.對于前者，Pyrosequencing是這樣進行的:假設(shè)研究者手中有若干份來自不同個體的基因組DNA樣品，要測這些不同樣品的同一SNP的頻率，那么研究者可以混合這些樣本的基因組DNA，然后做一次PCR，進行一次測序，研究者就可以得到該SNP在這些樣本中的頻率.如果研究者已經(jīng)有了各個樣本的PCR產(chǎn)物，也可以將PCR產(chǎn)物混合后進行一次PYRO，就可以知道該SNP頻率.已有的文獻已經(jīng)做過高達1126樣本的PCR產(chǎn)物的混合來確定SNP的頻率[2]。這種做法極大地減少了研究者的實驗次數(shù)和實驗消耗。一些其他研究也利用Pyrosequencing技術(shù)來確定SNP頻率[3，4]。如果是SNP位點的堿基種類的證實，需要首先得到特定SNP所在DNA片段，即PCR產(chǎn)物，然后在SNP位點的上游和/或下游設(shè)計測序引物，這樣通過對十幾個bp序列測定來確定SNP位點的堿基種類及SNP位點上下游十幾個堿基的序列.諸如四倍體馬鈴薯的一些SNP分析[5]和用于法醫(yī)研究的線粒體DNA SNP分析[6]也是利用Pyrosequencing技術(shù)進行的。

    下面我們以炭疽熱和幽門螺旋桿菌的分子診斷來具體說明Pyrosequencing技術(shù)在DNA序列分析和SNP研究中的應(yīng)用。

    細菌鑒定有很多方法，如表型表達(phenotypic expression)， 生物化學(xué)技術(shù)等.如果考慮操作費時和技術(shù)復(fù)雜，目前很多對細菌鑒定的方法并非最佳化。諸如引起肺結(jié)核的分支桿菌，其生長緩慢，經(jīng)常要培養(yǎng)幾周才能得到供生物化學(xué)分析，鑒定和株系/亞種分型(subtyping)的純凈培養(yǎng)物。通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)和生物化學(xué)分析方法對其檢測和鑒定費時且費用大，影響醫(yī)生給予患者最合適的治療。因為如果不能對細菌進行快速精確的鑒定，醫(yī)生只能給患者開廣譜抗生素，因而引發(fā)無效治療和細菌耐藥性。

    隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對細菌的分子診斷技術(shù)正在成熟.DNA所包含的遺傳信息決定了不同種生物之間以及同種生物的不同亞種/株系之間的差異。因此分子診斷對細菌的分型比傳統(tǒng)方法更為準確。對DNA的分析方法也有很多，如定量PCR，雜交(包括基因芯片)和DNA序列分析等。而只有DNA序列分析是黃金標準.很顯然，DNA包含的遺傳信息存在于DNA的ATCG排列次序中，搞清ATCG排列次序?qū)NA分析來說就是終結(jié)指標。如對諸如16S rRNA和內(nèi)源RNAse P (endoribonuclease P， RNase P)基因的序列分析可以判斷很多不同種類細菌或同種細菌的不同亞種/株系。

    土壤細菌Bacillus anthracis (B.anthracis)是引起炭疽熱嚴重感染的病原細菌。從接觸病原體到癥狀最初出現(xiàn)的感染發(fā)展過程一般為1到6天。如果確認受到B. anthracis攻擊，利用抗生素或解毒劑可以防治其感染，因此快速鑒定病原微生物種類和其致病力狀態(tài)具有很重要的意義。在接觸病原體的起初24-48小時內(nèi)攝入抗生素可以防治其傳染.抗體檢測的診斷方法可能比病情進展稍微滯后，而在這個時期的防治可能是失敗的。

    被稱為Ba813的一段DNA序列是B.anthracis的一個特異染色體標記，是B. anthracis區(qū)別于與其緊密相關(guān)的其他土壤桿菌種的標志。 Ba813長度為277bp，在染色體上為單拷貝[7]. 16S rRNA基因的序列分析被用于細菌分型，但不能用來分析B.anthracis，因為B. anthracis與B.cereus具有一樣的16S rRNA序列。

    B.anthracis的致病菌株有兩個質(zhì)粒，pXO1含炭疽熱毒素產(chǎn)生的基因( lef，cya，pag). pXO2編碼包裝和孢子形成所必須的產(chǎn)物[7]。目前，通過DNA雜交來檢測這些特異致病因子是鑒定B.anthracis的主要手段[7，8]。然而由于缺少一個或兩個質(zhì)粒的非致病菌株可能來自致病菌株[8]，因此此方法即不完全可靠又不快速。其他費時的方法包括gamma phage sensitivity tests和carbohydrate profiles[7]。

    本研究試圖建立新的鑒定B. anthracis及其致病狀態(tài)的方法，即利用Pyrosequencing技術(shù)分析PCR擴增的Ba813的20bp的序列來鑒定B. anthracis，并通過分析lef和位于pXO2的cap的基因序列來確定B. anthracis的致病狀態(tài)。

    提取B. anthracis的質(zhì)粒和染色體DNA，設(shè)計三對引物，分別擴增Ba813中的129 bp， lef基因的177 bp， cap基因的127 bp。每對引物的其中一條用生物素標記。

    采用偶連streptavidin的微珠(Streptavidin Sepharose™ HP， Amersham Biosciences AB， Sweden)和PSQ™ 96 Sample Preparation Kit (Pyrosequencing AB) 及其相關(guān)方法將PCR雙鏈分離，轉(zhuǎn)移至PSQ 96 SQA Plate的含生物素引物的單鏈PCR產(chǎn)物和測序引物退火。

    利用測序試劑盒SQA Reagent Kits (Pyrosequencing AB)和PSQ 96 DNA分析系統(tǒng)進行序列分析，結(jié)果用SQA軟件進行分析。

    通過對來自Swedish Defence Research Agency的13個B. anthracis分離物的Ba813的20bp片段的序列分析，其中12個分離物被明確鑒定為B. anthracis (Table 1)，另外一個由于PCR的失敗而被排除.同時也檢測了質(zhì)粒(Table 1). SQA軟件精確分析了11個分離物的核苷酸序列(大于等于20bp).其中一個序列的AA被錯讀為AAA，但這并不影響對細菌的鑒定.菌株鑒定的序列分析的精確度為99.6% (Table 2)，而致病力鑒定的序列分析的精確度為100% 。

    因此，利用PCR和Pyrosequencing技術(shù)的序列分析提供了一個可靠的鑒定Bacillus anthracis及其致病力的快速簡單的方法。與其他方法相比，此方法速度快，幾個小時出結(jié)果，而且結(jié)果精確。

    幽門螺旋桿菌與胃炎，胃潰瘍和胃癌都相關(guān)，對該細菌的分子診斷有三個方面。一是確定待檢病原體是否為幽門螺旋桿菌.通過分析待檢樣品是否含GCGCAATCAGCGTCAGT就可以解決該問題，這段序列是幽門螺旋桿菌16S rRNA基因中的一段，是幽門螺旋桿菌區(qū)別于相關(guān)細菌的重要標志[9，10]。幽門螺旋桿菌分子診斷的第二個內(nèi)容是幽門螺旋桿菌是否具有耐藥性.23S rRNA基因的兩個堿基的變異(A2142G和A2143G)與該細菌對抗生素Clarithromycin的耐受相關(guān)[11].第三個分子診斷內(nèi)容是評估感染該細菌的個體發(fā)展為胃癌的可能性，是通過分析IL-1B基因的三個SNP (-511C/T，-31C/T，+3954C/T)[12]。更詳細的資料請參考以下文章：

參考文獻
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[12] El-Omar EM， Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer. Nature， 2000， 404:398-402.

Principle of Pyrosequencing and its Application in DNA Sequencing and SNP analysis
Huang wenjin
[Abstract] Pyrosequencing is a new kind of method for DNA sequencing， analysis system based on Pyrosequencing can be used for DNA sequencing， SNP analysis and allele frequency determination. Principle of Pyrosequencing and its application is described in this article.
[Key words] Pyrosequencing DNA sequencing SNP analysis

 

 

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