西亞試劑：：Pyrosequencing 原理概述

Pyrosequencing是對(duì)短到中等長度的DNA序列樣品進(jìn)行高通量的、精確和重復(fù)性好的分析的技術(shù)。

第一步——測序引物和PCR擴(kuò)增的、單鏈的DNA模板雜交，與酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、熒光素（luciferin）孵育。

第二步——四種dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應(yīng)體系，如與模扳配對(duì)（A—T，C—G），此dNTP與引物的末端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來。

注意：反應(yīng)時(shí)deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因?yàn)镈NA聚合酶對(duì)dATPS的催化效率比對(duì)dATP的催化效率高，且dATPS不是熒光素酶的底物。

第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情況下催化焦磷酸形成ATP，ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素（oxyluciferin）的轉(zhuǎn)化，氧化熒光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號(hào)。
         ATP sulfurylase
PPi+APS —————————> ATP

            Luciferase，ATP
Luciferin —————————> oxyluciferin

       光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測并由軟件pyrogram™反應(yīng)為峰。每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。

第四步——ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系。

第五步——然后加入下一種dNTP。

    在以上步驟循環(huán)進(jìn)行中，互補(bǔ)DNA鏈合成，序列從pyrogram™的信號(hào)峰中決定。

    利用PSQ96系統(tǒng)進(jìn)行測序分析可期望得到20-30個(gè)堿基的讀序長度，但是和任何測序技術(shù)一樣，最大讀序長度取決于模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)、堿基組成、PCR產(chǎn)物質(zhì)量和其他參數(shù)。

最佳化的Pyrosequencing
    Pyrosequencing反應(yīng)利用的是酶級(jí)連系統(tǒng)，簡單且強(qiáng)有力，給出陽性或陰性結(jié)果，每種成份和參數(shù)已最佳化，以得到高度一致的結(jié)果，精確度為99%。
* 底物濃度已最佳化
* 選擇了Apyrase的特異濃度，保證了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPS
* dNTP降解速率慢于摻入速率，有利于dNTP充分摻入
* ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP濃度和光產(chǎn)生正比于摻入的dNTP
數(shù)目
* 仔細(xì)控制的試劑，保證了足夠的活性和質(zhì)量

待測序模扳制備
    通過PCR技術(shù)將待測序列擴(kuò)增，其中引物之一在合成時(shí)用生物素標(biāo)記。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于擴(kuò)增的DNA中，DNA分子通過引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成復(fù)合體。DNA變性后，帶生物素標(biāo)記引物的單鏈在磁場中得到純化，然后就可用于與測序引物退火，以便進(jìn)行測序反應(yīng)。


PSQ 96系統(tǒng)系統(tǒng)工作流程
1, 基因組DNA提取
2, 設(shè)計(jì)和合成PCR引物，其中之一標(biāo)記生物素; PCR反應(yīng)
3，DNA雙鏈的分離，含生物素的單鏈DNA與測序引物的退火
4，對(duì)含生物素的單鏈DNA的測序/基于測序的SNP分析及等位基因頻率確定

PSQ96系統(tǒng)包含了進(jìn)行上述工作（3-4）的儀器及配件、軟件、試劑，系統(tǒng)的設(shè)計(jì)滿足高通量、快速、精確和經(jīng)濟(jì)的要求。

系統(tǒng)定購信息（進(jìn)行SNP analysis, allele frequency determination 和sequence analysis等工作的系統(tǒng)）

System and softwares
PSQ 96 System/SNP/AQ/SQA (220-240V) Code No: 60-0085

SNP Reagent Kit（進(jìn)行SNP分析的KIT）
Kits contain all components needed for SNP analysis:
●Enzyme mixture (DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase, apyrase)
●Substrate mixture (luciferin, adenosine 5’ phosphosulfate)
●Nucleotides (dATPS, dCTP, dGTP, dTTP)
●Reagent cartridge

PSQ 96 SNP Reagent Kit 5x96
- perform up to 480 SNP analyses Code No: 40-0005
PSQ 96 SNP Reagent Kit 1x96
- perform up to 96 SNP analyses, includes 1 x 96-well plate. Code No: 40-0001

SQA Reagent Kits(進(jìn)行序列分析的KIT)
Kits contain all components needed for sequence analysis, optimized to allow for the number of nucleotide dispensations required when analyzing a gene-specific sequence.
●Enzyme mixture (DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase, apyrase)
●Substrate mixture (luciferin, adenosine 5’ phosphosulfate)
●Nucleotides (dATPS, dCTP, dGTP, dTTP)

PSQ 96 SQA Reagent Kit
- perform up to 96 SQA analyses Code No: 40-0006

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛