西亞試劑：：　環(huán)狀PCR

　環(huán)狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。這2種PCR都是根據(jù)一端已知序列設(shè)計(jì)的嵌套式引物進(jìn)行PCR。

　　1.3.1　I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一種基于PCR的改進(jìn)的染色體步行方法。

     I-PCR的實(shí)驗(yàn)程序包括，基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產(chǎn)物為底物，用根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物(流程如圖1所示)。

　　韓志勇等以I-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)克隆了轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列。先用小量法提取轉(zhuǎn)基因水稻的總DNA，總DNA用10倍過(guò)量的限制內(nèi)切酶進(jìn)行過(guò)夜酶切，酶切片段進(jìn)行自連接，然后根據(jù)工程質(zhì)粒的T-DNA區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)反向引物，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增旁側(cè)序列。建立了適合于處理大量材料的克隆轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因旁側(cè)序列的技術(shù)體系。在1周內(nèi)克隆了35個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系中外源基因的旁側(cè)序列，長(zhǎng)度在300～750bp之間。I-PCR法快速、高效、穩(wěn)定，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，花費(fèi)少，PCR引物設(shè)計(jì)比較方便。

　　1.3.2　P-PCR P-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物，3個(gè)引物在已知序列內(nèi)呈線性排列，其中第3個(gè)引物可作為接頭使用，可與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成鍋柄狀單鏈模板。其過(guò)程為，首先酶切基因組DNA，產(chǎn)生5'或3'粘末端，然后連接上合適的接頭(primer 3)，連接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接頭，由于連接上的接頭與已知序列是反向重復(fù)序列，變性后的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之后分別用3個(gè)單引物進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，能有效地?cái)U(kuò)增2～9kbp的大片段未知序列(流程如圖2所示)。 

　　黃君健等成功地應(yīng)用P-PCR技術(shù)從正常的人外周血單核細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增端粒催化亞基hTERT基因5'端上游旁側(cè)序列，獲得了hTERT基因翻譯啟始位點(diǎn)上游2090bp的基因組DNA序列。首先用酶切消化基因組DNA，得到帶有GATC的5'突出端的DNA片段。然后利用已知的hTERTcDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出1條大約900bp的基因組特異片段，序列分析為hTERT的基因組DNA片段。根據(jù)得到的基因組DNA序列的信息，確定P-PCR的引物退火區(qū)，并合成了5'磷酸化的連接寡核苷酸和4條基因特異性引物，其中連接寡核苷酸5'端的4個(gè)堿基CTAG與上述核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的5'突出端GATC互補(bǔ)，然后將連接寡核苷酸與基因組酶切產(chǎn)物連接，以連接產(chǎn)物為反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR，使模板自身進(jìn)行退 火-延伸反應(yīng)，以形成Panhandle結(jié)構(gòu)。最后以單鏈Panhandle為模板，4條基因特異序列為引物進(jìn)行嵌套式PCR，最終獲得了1條約2kb的含hTERT基因啟動(dòng)子的DNA片段。Jones等利用改進(jìn)的P-PCR，在形成panhandle結(jié)構(gòu)之前3'末端連上ddCTP，使引物錯(cuò)配的機(jī)率減少，特異性增加。他們從人類(lèi)基因組

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