西亞試劑：：單化后細胞特點和處理

G418的轉(zhuǎn)染實驗總結

從G418篩選，轉(zhuǎn)染到單克隆化的系列操作,有網(wǎng)友對此進行一些總結,希望對大家有所幫助.

篩選之前確定G418濃度：
1，由于每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。
2，G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細胞的。但是新霉素對真核細胞無作用而G418對細菌和真核細胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進行轉(zhuǎn)染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時不加其它抗生素。
3，匯合度對G418篩選結果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%
4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418濃度范圍內(nèi)進行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。一個具體試驗：3*106個細胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例1/300孔內(nèi)應該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。

加藥時間和維持濃度
1，由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達。一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑出單后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。
關于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。

篩選時的培養(yǎng)液
加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現(xiàn)兩個問題：
1， 死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液
2 ，孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應用這種培養(yǎng)基。
3，適當增加血清濃度。

篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法：
1， 問題1。做hela細胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？
a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；
b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴散；
c、顯微鏡下觀察細胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀
d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細胞尚未完全松散開，可以再重復的，直到松散開，能夠被吸走為止。
我的建議：1、在100mm dish中挑克隆，細胞分的稀一點。2、把細胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單
2，問題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達的概率我認為大概有70－80％，但是想挑到表達量高且能穩(wěn)定表達的，不大容易。這個可能是在染色體上，合適的整合位點太少的緣故。
3，問題3。細胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽性均出現(xiàn)不同程度的細胞形態(tài)的改變。
想請教各位有經(jīng)驗的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細胞。不過，我轉(zhuǎn)的是一種抑癌基因。
4，問題4。單克隆化的時機和個數(shù)：加藥篩選時, 一般等到確認的轉(zhuǎn)染細胞長到70%以上時,再做有限稀釋法, 以克隆出陽性細胞, 同時要保持適當?shù)乃幬餄舛?以防突變和污染。若細胞長好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個克隆就有需要的，但保險起見，篩10個吧。
5，從單化時開始，就要加大營養(yǎng)，清和生長因子。

單化的操作方法；
1.方法1。單克隆細胞的培養(yǎng)就是這樣的,我現(xiàn)在作了15個96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時候應保證每個孔中的細胞是一個,因此,我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個的細胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結果你所說的現(xiàn)象我也遇到過,我也百思不得其解,只好做多一點的96孔板來補充。培養(yǎng)SPC-A1（人肺癌細胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進行了G418抗性篩選和96孔板單篩選，最終獲得了成功將我的實驗步驟寫出來，希望對你有所幫助。
2.方法2。實驗步驟大致為：預先對96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，0.1ml/孔，并放于細胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定表達GFP的細胞，細胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細胞懸浮液，上述細胞液接種于96孔板的第一排，0.2ml/孔，從中吸取0.1ml細胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1ml接種于第三排……，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細胞液，操作示意圖見下圖。一般來說，每一列都會有某個孔中只有1~2個細胞。
3.方法3。我的改進之處：我在顯微鏡下觀察，標記孔中小于10個細胞的孔，然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細胞圈住，然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共獲得了6株單。但需注意的是：時間不能超過30min，否則細胞極容易死亡。解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細胞，然后用牙簽練習，我練了5～6次后非常熟練了
培養(yǎng)液：最好是含15％的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細胞液進行過濾，過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作為單的培養(yǎng)液。
4.方法4。我曾經(jīng)幫同事做過挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺內(nèi)紫外照射30分鐘，然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個，然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，在有些變圓時，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細胞松散擴散開了時，已經(jīng)吸了將近十個克隆了，動作快一些時能吸十幾個，我做過幾次了效果很好，沒有出現(xiàn)污染。（在要進行操作時，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會有什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。
5.方法5。關于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來作，但是我們實驗室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單的，一般的做法都是這樣：
1。3.5cm皿鋪細胞，長到大概80％以上的時候作轉(zhuǎn)染。
2。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個大皿（1：6）或者兩個大皿（1：12）。
3。再過一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。
4。依據(jù)細胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來的細胞就形成單。
5，單長到相對較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細胞集落，一般挑上48個，種在兩塊24孔板上。
6。于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據(jù)western結果確定真陽性。

我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對細胞生長抑止作用強大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到stable。當然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過50％就相對比較容易了，10％以上的可能最后形成的細胞集落就少，而且真陽性也較少。對于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細胞，我會連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細胞長滿了就傳代），好像比較有效。
除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時也多

單化后細胞特點和處理：
1.單后細胞生活習性改變：考慮質(zhì)粒的表達對細胞的生長有一定的影響，查文獻確認一下。
2.單后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時保證板子不影響細胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。
3.篩選成單后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時如果不出現(xiàn)死亡細胞則可以認為是穩(wěn)定細胞系。復蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。
4.過一段時間再篩選時，G418的濃度有人認為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時小寫，此外，加藥后對蛋白質(zhì)的表達，細胞形態(tài)有影響，因此做功能時要停藥培養(yǎng)合適時間后再做。
5.穩(wěn)轉(zhuǎn)PA317細胞后再此篩選（需要隔一段時間再加壓篩一次），細胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用合適的濃度。可以在細胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時間，然后再加你維持細胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。
6.有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時間后，板子上出現(xiàn)了幾個克隆，如果有幾十個克隆，然后挑其中七八個到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長滿后再轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長差不多滿后，每孔消化下來大概一半做WB鑒定目的基因表達，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結果出來有陽性的孔就保留下來，陰性的丟掉。

單化后鑒定：
1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時轉(zhuǎn)染表達是增高的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強啟動子下,穩(wěn)轉(zhuǎn)時你得到的細胞株可能失去了此啟動子,或者是改變了細胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對照鑒定一下!
2.轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達你想要蛋白的單可以認為是整合了質(zhì)粒的。

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛