西亞試劑：：瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法

瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法

        20世紀(jì)70年代是一個奠定現(xiàn)代分子生物學(xué)的時代，1973年冷泉港實驗室的Joseph Sambrook和Phillip Sharp發(fā)明了利用瓊脂糖凝膠分離DNA和EB染料觀測DNA相結(jié)合的技術(shù)?，F(xiàn)在，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化核酸和蛋白質(zhì)片斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。這里首先介紹的是瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法：

1.柱回收試劑盒：可謂目前最簡單快速的回收方法，只需要將電泳凝膠中的產(chǎn)物條帶切下，用溶解Buffer徹底溶解，上包埋有純化填料的純化柱，離心，再洗滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫。全程不過10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以直接用于后繼實驗。這個方法幾乎不需要什么技巧就能得到穩(wěn)定的結(jié)果，也是目前最多商品化試劑盒選擇的方法。但是這個方法不適合用于大片斷的回收。

2.玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒：這個方法比前面的方法更為靈活，可以根據(jù)每次回收實驗時預(yù)期回收量來調(diào)整純化填料的量，使得實驗不受限于柱子的載量，也不會造成浪費(fèi)。前面的操作步驟和上者一樣，將電泳凝膠的條帶切下，Buffer溶解，（區(qū)別在于這里）加入純化填料填料吸附混合，快速離心沉淀去上清，洗滌沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脫液純化介質(zhì)中吸附的片斷釋放出來，離心，取上清，就是回收的產(chǎn)物。這個方法適合各種不同大小的片斷，特別是大片斷的回收，但是操作就較前者復(fù)雜一些，涉及到多次離心沉淀和取上清，有可能會誤吸了微量的沉淀；另外干燥的程度也有點(diǎn)技巧，干過了不好洗脫，沒干透又影響結(jié)果。后來的改進(jìn)版本有將混合了純化介質(zhì)后的凝膠溶解液加入到一種離心過濾柱上，這種柱子不帶純化填料，只有一層過濾膜，離心過濾后，填料在柱子里，溶液被甩掉，這樣就避免了上述的問題。

3.低熔點(diǎn)瓊脂糖：傳統(tǒng)手工操作方法之一，低熔點(diǎn)瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割目的條帶，在TE溶液中65度保溫融化，用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。這個方法需要用到酚氯仿等有機(jī)試劑，由于乙醇沉淀需時較長，現(xiàn)在用的人已經(jīng)不多了。想當(dāng)年經(jīng)費(fèi)緊張的時候，低熔點(diǎn)瓊脂糖貴，不舍得這么浪費(fèi)的，比較取巧省錢的法子就是常規(guī)瓊脂糖電泳后，在目的條帶前方挖槽，灌入低熔點(diǎn)瓊脂糖，凝膠后再電泳一小會兒，等條帶進(jìn)入低熔點(diǎn)瓊脂糖區(qū)域再將那塊家伙切出來，就可以非常非常節(jié)約了。除了直接酚抽低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，還有人用瓊脂糖酶來消化瓊脂糖凝膠，條件也相當(dāng)溫和，只是那酶價格并不便宜（光那酶的成本就至少5-6塊，還不算其他的麻煩事），多數(shù)的酶只適合用低熔點(diǎn)瓊脂糖，問題是我不用酶也可以直接酚抽，費(fèi)時間還特長，所以，并不覺得特別好用。后來據(jù)說T家的瓊脂糖酶可以用于常規(guī)瓊脂糖，前提是你有辦法在65度把那膠化了。但那需要極好的耐心。

    后來有老師從美國回來了，才有機(jī)會嘗試更好的低熔點(diǎn)瓊脂糖——FMC（現(xiàn)在叫做Cambrex了）的GTG級別低熔點(diǎn)瓊脂糖！那才是最簡單的方法呀！洗的超級干凈的電泳槽灌膠，電泳后，直接將條帶切下65度保溫融化，就可以直接在融化的瓊脂糖—DNA混合物中加酶進(jìn)行后繼實驗——所謂的GTG就是遺傳技術(shù)級，可以在凝膠中進(jìn)行各種酶反應(yīng)的哦！實驗條件非常溫和，非常適合大片斷的回收。

4.透析帶電洗脫法。煩，簡直不堪回首。切下的條帶放在充滿TAE的透析帶中再電泳一段時間，讓DNA走出凝膠，走向溶液中，再反向電泳一會兒，將附在透析帶上的DNA趕回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后傳統(tǒng)方法酚抽沉淀，那塊膠通常還要再染色看看殘留。由于綁透析帶非常難搞，只有在萬不得已的非常大的片斷時才會考慮的。也是丙烯酰胺電泳凝膠產(chǎn)物回收的方法之一。

    后來看到以色列的一個小公司GeBA有出簡易透析管，就是將小指管兩邊各開一小窗，貼上透析膜，把膠塊放在管中再電泳。由于不需要綁透析帶，使用方便；而且管中溶液體積小，容易處理；膜的面積也小吸附也少；頓時覺得是救星。后來貌似Pierce也推出了類似的東西，買起來更方便一點(diǎn)。

5.DEAE纖維素膜紙片法和其他改良法。早期實驗室最常用方法之一。將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳一會兒，條帶上的DNA被膜片截留，取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管中加緩沖液65度保溫洗脫，直到膜上沒有DNA了，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。這個方法不適合做較大的DNA，因為洗脫比較困難。

    曾經(jīng)常用的另一方法是在電泳膠前挖小槽，加入緩沖液，電泳一小會兒，手提紫外監(jiān)視，等條帶進(jìn)入槽中，還沒在另一頭上岸時停止電泳，吸出溶液酚氯仿抽提（加點(diǎn)甘油可降低DNA在溶液中的移動速度，防止那邊還沒全部下水，這邊就已經(jīng)上岸了的情況。當(dāng)然也可以挖大點(diǎn)的孔或者多吸幾次，反正是要沉淀的，體積大些不要緊）。不過這些方法在柱回收試劑盒推出后都漸漸要淘汰了。畢竟比較麻煩費(fèi)時間，而且回收的產(chǎn)物純度也不比試劑盒——前者是純化介質(zhì)吸附DNA后徹底除去溶液，經(jīng)過洗滌殘留在純化介質(zhì)上的雜質(zhì)，最后洗脫；手工的方法多是用酚氯仿抽提溶液后乙醇沉淀，由于有些多糖沉淀屬性和DNA相似時就容易共沉淀下來。鑒于競爭的日趨激烈,純化試劑價格逐漸向下,連核酸純化領(lǐng)域的頂級名牌Qiagen也開始大幅度的折扣優(yōu)惠,所以,有條件還是選擇試劑盒,比自己慢慢摸索要更能節(jié)約寶貴的青春

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