西亞試劑：：常規(guī)片段的瓊脂糖凝膠回收

常規(guī)片段的瓊脂糖凝膠回收

常規(guī)片斷級的選擇指南：所謂常規(guī)級，即回收片段大小介于100bp和10kb之間，在這個范疇內(nèi)包含了一般的質(zhì)?；蛘呖寺∑蔚幕厥铡Ｖ髁鞣椒ㄊ侵厥赵噭┖?。

1. Qiaquick Gel Extraction Kit

品牌：Qiagen
回收范圍：70bp-10kb
價格：（50包裝1,350，250包裝6,372，約27元/反應，現(xiàn)有半價活動，價格非?？捎H！）
特點：

高達80%回收率

操作快速簡單，3步完成70bp-10kb片段的回收

提供三色指示劑的電泳上樣loading  Buffer,方便判斷和操作

回收產(chǎn)物純度高，可用于同位素或熒光測序、芯片分析、連接轉(zhuǎn)化、酶切、標記、PCR、顯微注射、體外轉(zhuǎn)錄等后繼實驗

使用心得：

    Qiaquick最引以為傲的就是非常穩(wěn)定的質(zhì)量，高回收率和方便的步驟。產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可靠，一向是實驗首要條件。畢竟，實驗步驟是環(huán)環(huán)相扣的，每一步出現(xiàn)問題都會導致后患無窮，費時費力，還更費錢，對心情更是一種折磨。用試劑盒不就圖省事和可靠嗎？從核酸純化領(lǐng)域起步的Qiagen，在全球?qū)嶒炇叶枷碛袠O好的口碑，是值得信賴的選擇。因為Qiagen有強大的研發(fā)隊伍，精益求精優(yōu)化實驗操作的每一環(huán)節(jié)，絕非普通臨摹制品、仿制品可比。以回收率為例，我們前面提到，由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。所以Qiagen以嚴謹?shù)膽B(tài)度提供多種條件下的詳細介紹：

使用QIAquick回收之前和回收之后再混合的DNA片段 (大小已指出) 。對所有尺寸的片段均獲得了接近80％的回收率。
A  1–5: 回收之前; P: 回收之后再混合。樣品使用 1.5% 瓊脂糖凝膠分析(TAE buffer)。
B  1–3: 回收之前; P: 回收之后混合。樣品于 3.5% 高分辨瓊脂糖凝膠上分析( TAE buffer)。M: pTZ-HinfI marker。

     記得《分子克隆II》里曾經(jīng)說少于500ng的DNA幾乎沒有回收價值，看看上表就可以發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在的技術(shù)發(fā)展，即使是少到100ng的DNA還有70%的回收率呢！而且操作方法還很簡單。

    雖然是幾乎不需要實驗技巧的簡單操作，如果你注意到一些小技巧 還是很有幫助的。DNA回收純度取決于純化介質(zhì)對DNA吸附的特異性、洗滌雜質(zhì)是否徹底。而DNA回收率和濃度則與elution buffer的體積，以及buffer在柱子上停留的時間有關(guān)。較大的洗脫體積可以提高回收率，充分洗脫，但是會造成產(chǎn)物濃度太低不好用。比如100-200ul的洗脫液可以徹底洗脫純化柱吸附的DNA，不過考慮到后繼實驗的方便，Qiaquick建議使用50ul的洗滌液，正對加入膜中央（避免加在管壁上而不能充分接觸純化介質(zhì)），可以完全浸潤回收柱上的純化膜。最低建議采用30ul洗脫液，但是可能會降低回收率。有人試過用15—25ul洗脫2次，覺得這樣第一次濃度高第二次比較充分，其實沒有必要，只要適當延長在柱上停留的時間，就有助于提高得率——Qiagen的Protocol說明，30ul停留1分鐘要比50ul停留1分鐘回收濃度高1.7倍。充分離心（保證速度和時間）有助于提高得率和純度，減少殘留對后繼實驗的影響（這個方法要注意不是所有試劑盒都可以使用，因為有些試劑盒的純化柱填料松一些，離心有時可能導致少量填料脫落，而Qiagen的這個產(chǎn)品是膜式的，結(jié)合非常牢固，中大有人用這個柱子高溫消毒后重復使用，效果不賴，可見皮實。當然這是廠家絕對不推薦的）。

    其他的技巧也是大家熟知的，比如切膠的時候要盡量減少切膠體積（不超過400mg），由于Qiaquick柱子的載量達到10ug，如果膠塊實在太大而預期DNA總量不超過10ug，可以用大一點的管溶解，分幾次上柱離心吸附后再洗滌。注意的是紫外照射時間不要太長，因為紫外線對DNA（特別是對于較大的片段）有影響。還有就是溶膠要徹底，用槍頭把膠塊弄碎一點有助于50度下快速溶解。溶解完全后溶液的顏色指示溶液的pH值，如果變色需要調(diào)pH值以防止實驗失敗。需要用ddH2O或者TE洗脫的，注意pH在7.0—8.5之間的回收率最高?；厥章屎推瑪啻笮?、多少有關(guān)，較大的片斷（7kb以上）回收率會有所降低，洗脫液預熱到50度再加入純化柱膜中央，有助于提高產(chǎn)率。

    除了比較適合個人使用的傳統(tǒng)離心式，Qiagen還提供抽濾式的膠回收試劑盒，用抽濾的方法替代離心，使得實驗可以連續(xù)進行，特別適合批量進行的需要——想象看，你只要將溶膠液加入裝配好的抽濾管中，嘩一下就抽干了，再加洗滌的試劑，嘩一下又好了，多快呀！節(jié)約很多時間和功夫，不需要在離心機前面拿進拿出。以后的全自動操作模式就是這樣的啦！

    看到這里可能大家都會說Qiagen的東西好是好，但是就是貴，一般的實驗室都舍不得平時用，往往留著關(guān)鍵時刻做，不錯，好東西自然不便宜，不過他們有時候也會打折促銷

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