西亞試劑：：大片段DNA的瓊脂糖凝膠回收

大片段DNA的瓊脂糖凝膠回收

大片段：指的是片段大小超過10kb的DNA片斷，由于越長的DNA分子和純化膜的結(jié)合力越強(qiáng)，洗脫力越差，在離心過柱時(shí)可能被“扯斷”，因此常規(guī)的離心過柱的方法并不適合大片段DNA的回收。在凝膠電泳的大片斷回收，特別是幾十kb的大片斷，經(jīng)典方法是電洗脫。此外，低熔點(diǎn)瓊脂糖和瓊脂糖酶消化也是常常有人選用的方法，新興的方法是用玻璃奶或者純化填料。其實(shí)無論用什么方法，在回收大片斷時(shí)一定要牢記你對(duì)付的是大片斷，操作時(shí)一定要小心注意，粗暴的操作，最后結(jié)果也是自己來承受的。

    這些方法中，速度最快的就是玻璃奶或者純化填料珠的試劑盒了。畢竟，誰愿意為一個(gè)小小的膠回收浪費(fèi)2個(gè)多小時(shí)呢？有那功夫干點(diǎn)別的不好？我最早用的其實(shí)是當(dāng)時(shí)的Pharmacia（后來改為Amersham，現(xiàn)在是GE Healthcare Life Sciences）的一個(gè)玻璃奶（Glassmilk）試劑盒?，F(xiàn)在記得Glassmilk的人應(yīng)該不多了，在當(dāng)時(shí)卻是我們眼中的神奇寶貝——半個(gè)多小時(shí)就可以完成本來要搞2個(gè)多小時(shí)的活：溶膠液溶膠后，加入10ul混勻的玻璃奶溶液，混勻靜置吸附后，離心去上清，再清洗1—2次，干燥，最后用洗脫液洗脫，離心取上清即可。

1.QIAEX II

產(chǎn)地：Qiagen
回收范圍：40bp-50kb

特點(diǎn)：

通用性高：一般或者低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，TAE或TBE，以及聚丙烯酰胺凝膠
無NaI干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)
大片段DNA保存較好，不會(huì)被剪切
使用心得：

    這個(gè)試劑盒不同于Qiagen其它的膠回收試劑盒，利用的是配合高離液鹽（chaotropic salt）的silica-gel particles，因此QiaEX可以從鹽，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，染料，蛋白以及核苷酸中無需苯酚抽提或者酒精沉淀即可獲得純化DNA片段。這個(gè)試劑盒使用方法和玻璃奶的試劑盒基本一樣，區(qū)別在于玻璃奶是粉碎的玻璃，因此可能存在大小不一、邊緣尖銳等情況，在離心力下，大小不同的碎片的沉降系數(shù)不同而導(dǎo)致在沉淀中分布位置不同，當(dāng)長片斷一頭粘附在大片斷一頭吸附在小片斷上，離心產(chǎn)生的剪切力就會(huì)導(dǎo)致長片斷的斷裂。而QiaEX的純化填料是人工特制的大小均一的球形小珠（Beads），能更好的吸附DNA，也不易產(chǎn)生上述的剪切力問題，使得回收的大片斷DNA更為完整。

    無論是玻璃奶還是純化填料，比起過柱的方法，優(yōu)點(diǎn)在于適用于較大范圍的DNA回收，從小片斷到超級(jí)大片斷都可以，適用范圍廣；而且每次反應(yīng)可以根據(jù)估算的待回收DNA的量來放大或者縮小純化試劑的量，比較靈活。比如QIAEX說是150反應(yīng)（每次5ug），實(shí)際上往往可以用200多次或者更多。

    但是這個(gè)方法的問題有2個(gè)，一個(gè)是比較麻煩，需要一定操作經(jīng)驗(yàn)——無論是清洗或者是最后的洗脫，離心后要盡量多取上清而不干擾沉淀，多少有點(diǎn)點(diǎn)難度，特別是最后取洗脫的DNA，要舍得放棄最后那點(diǎn)上清，免得回收產(chǎn)物中混入了純化介質(zhì)，在后面的實(shí)驗(yàn)中得不償失。所以，你可以從此想象，由于每次離心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的，去除始終不徹底，這就注定了這個(gè)方法純化的產(chǎn)物純度不如離心高，回收率也不如那么高。你看，QIAEX說這個(gè)回收產(chǎn)物可用于酶切、連接、標(biāo)記和PCR，但是就沒有提到顯微注射芯片分析等更高要求的實(shí)驗(yàn)。另一個(gè)問題是干燥的程度如何把握需要一定經(jīng)驗(yàn)——干過頭了洗脫困難，沒干透就會(huì)將酒精帶入后繼實(shí)驗(yàn)——要干到沙面雪白而靠管壁的最邊緣還有丁點(diǎn)透明就可以了。當(dāng)然，這個(gè)現(xiàn)象描述起來不著邊際，做過的人就心中了了。洗脫體積通常是20ul。操作要領(lǐng)除了前面提到的問題，就是離心充分，離心后取管子動(dòng)作輕快，事前調(diào)好加樣槍，取上清要輕，靠壁、放槍緩，動(dòng)作利索，不要千萬不要來回抽。舍得放棄。

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛