西亞試劑：：從RNA中提取mRNA的方法

從總RNA中分離mRNA

采用Promega公司的PolyATract® mRNA Isolation System III。
 
使用該試劑盒，mRNA產(chǎn)量極低，因此下述方法是以Promega公司試劑盒操作手冊(cè)為基礎(chǔ)，并采用儲(chǔ)昭暉碩士(作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物分子生物學(xué)水稻分室)所建議的改進(jìn)方法綜合而成。

由使用者自備的材料

65℃水浴
　　無菌的、無RNase的1.5ml塑料離心管
　　f無菌的、無RNase的加樣槍和槍頭

操作步驟

1.探針的退火

1）在一個(gè)無菌的、無RNase的離心管中，加入未稀釋的總RNA溶液，使終體積達(dá)到1.5ml?？墒褂酶罅康目俁NA，其濃度可至過飽和，即有絮狀RNA沉淀析出，但當(dāng)有絮狀RNA沉淀存在時(shí)，后續(xù)的退火反應(yīng)操作會(huì)受到一定程度影響；也可使用更少量的總RNA(50ug)，但mRNA產(chǎn)量可能無法保證。

2）將離心管置于65℃水浴中10分鐘或略長(zhǎng)時(shí)間。

3）加入15ul 的Biotinylated-Oligo(dT)探針和39ul的20×SSC到RNA中。顛倒數(shù)次以混勻，靜置于室溫下至充分冷卻。這將需要10分鐘或略少的時(shí)間。在該溶液冷卻期間，制備0.5×和0.1×SSC貯存液

2.貯存液制備

1）通過在三個(gè)無菌的、無RNase的離心管中各自混合30ul的20×SSC和1.170ml的無RNase的水來制備三份1.2ml的無菌的0.5×SSC。

2)通過在三個(gè)無菌的、無RNase的離心管中各自混合7ul的20×SSC和1.393ml的無RNase的水來制備三份1.4ml的無菌的0.1×SSC。

3.鏈霉抗生物素蛋白-磁珠(Streptavidin-Paramagnetic Particles)的漂洗

1）取三管鏈霉抗生物素蛋白-磁珠，輕彈離心管的底部使SA-PMPs重懸直至其充分分散，吸取懸液合并于一管。

2）使匯總的SA-PMPs重懸直至其充分分散，然后將離心管置于磁柱中直至SA-PMPs已經(jīng)聚集在離心管壁上(大約30秒)。小心地移出上清。不要離心沉淀顆粒。

3)用0.5×SSC漂洗SA-PMPs三次(每次0.9ml)，每次都使用磁柱來捕獲它們，然后小心地移去上清。

4)重懸漂洗過的SA-PMPs于0.3ml的0.5×SSC中。

4.Oligo(dT)-mRNA退火雜合體的捕獲和漂洗

1）將退火反應(yīng)的全部成分加入到含有漂洗過的SA-PMPs的離心管中。

2）室溫下靜置10分鐘。每1-2分鐘輕柔地顛倒一次以混勻。

3）用磁柱捕獲SA-PMPs，小心移去上清，注意不要攪動(dòng)SA-PMPs顆粒。當(dāng)總RNA為過飽和高濃度時(shí)溶液時(shí)，退火反應(yīng)易形成黑色絮狀物，磁柱吸附也難以壓縮其體積，這時(shí)應(yīng)小心吸取上清；保留上清直至確信mRNA的結(jié)合與洗脫已是令人滿意。

4）用0.1×SSC(每次0.9ml)漂洗顆粒4次，其間輕彈離心管底部直至顆粒已被重懸。最后一次漂洗后，在不攪動(dòng)SA-PMPs的前提下，以8000rpm離心1分鐘，盡可能多地移出液相。

新型的基因分型技術(shù)(SNP分型):巢式PCR-RFLP技術(shù)

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛