西亞試劑：：姊妹染色單體色差方法

在DNA復制過程中，核苷的類似物5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine簡稱BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2′-deoxyuridine簡稱IdUrd）可以代替核苷酸摻入新合成的DNA鏈，并占有胸腺嘧啶（Thymidine，T）的位置。哺乳類細胞在含有適當濃度的BrdUrd的培養(yǎng)液中經(jīng)歷二個分裂周期之后，其中期染色體的兩個單體的DNA雙鏈在化學組成上就有了差別：即一條染色單體的兩股DNA的T位完全由BrdUrd代替，而另一條染色單體的兩股DNA中的一股含BrdUrd，另一股則不含 BrdUrd。這樣的細胞經(jīng)過制片和苯并咪唑熒光染料（Hoechst-33258）染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到兩條姐妹染色單體顯示強弱不同的熒光。兩股DNA鏈都含有BrdUrd的單體熒光較強，其中只有一股有BrdUrd的單體熒光較弱。但由于熒光染料發(fā)出的熒光消失較快，只能立刻在熒光顯微鏡下照相而不能長期保存。1974年Korenberg和Freedlender改進了這一技術，單獨用Giemsa染色即獲得姐妹染色單體差別染色（sister-chromatiddifferentialstaining簡稱SCD）。

來自一個染色體的兩條單體之間同源片斷的互換稱為姐妹染色單體互換（sister-chromalidexchange，簡稱SCE）。這種互換是完全的，對稱的。由于姐妹染色單體染色上的明顯差異，如果姐妹染色單體間在某些部位發(fā)生互換，則在互換處可見有一界限明顯、顏色深淺對稱的互換片段，故SCE易于計數(shù)，即使在一定距離內(nèi)發(fā)生多次互換，也可被檢測出來。

目前認為SCE反映了DNA的損傷，可以使用SCE作為哺乳類動物突變形成的指標。由于SCE分析方法比觀察染色體畸變更簡便、迅速、敏感，并表現(xiàn)出很好的劑量效應關系，因此，目前已將此法列為檢測誘變劑或致癌物的常規(guī)指標之一。

 

實驗試劑

 

1. RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、鏈霉素，姬姆薩染液等。

2. 小牛血清：最好經(jīng)過透析處理。將小牛血清裝入透析袋中，用線扎緊封口，小心檢查，切勿有漏孔。然后將透析袋放在盛有雙重蒸餾水的玻璃器皿中，每隔1—2小時換一次水，擱置在4℃冰箱中，24小時后賽氏濾器滅菌過濾。

3. 3.5％NaHCO₃溶液：稱3.5克NaHCO₃，用100毫升雙蒸水溶解，10磅15分鐘高壓滅菌，調(diào)節(jié)pH用。

4. BrdUrd 溶液：用無菌青霉素瓶，在普通條件下用分析天平稱取BrdUrd2毫克，然后在無菌室內(nèi)加入滅菌生理鹽水4毫升，母液的濃度為0.5毫克/毫升。用黑布避光，置冰箱中保存。最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

5. 1mol/LNaH₂PO₄，pH8.0的溶液；稱取120克NaH₂PO₄，加入1000毫升雙蒸水，用NaOH粉末調(diào)pH至8.0即可。

6. 2×SSC溶液（0.3mol/L氯化鈉，0.03mol/L枸櫞酸鈉，稱取NaCl17.54克，枸櫞酸鈉8.82克，各用蒸餾水1000毫升溶解，使用時兩溶液等量混合。

7. pH為6.8 的mol/L/15磷酸緩沖液：

甲液：取KH₂PO₄9.08克，溶于1000毫升蒸餾水中。

乙液：取Na₂HPO₂·2H₂O11.88克或Na₂HPO₄·12H₂O23.87克，溶于1000毫升蒸餾水中，將50.8毫升的甲液與49.2毫升乙液混合，即得pH為6.8的mol/L/15磷酸緩沖液。

 

實驗設備

 

1. 2毫升和1毫升滅菌注射器

2. 吸管，移液管，離心管

3. 量筒，燒杯

4. 無菌青霉素瓶，試劑瓶，培養(yǎng)瓶

5. 酒精燈

6. 載玻片

7. 天平

8. 紫外燈（15W）

9. 離心機

10. 恒溫培養(yǎng)箱

11. 顯微鏡

 

實驗材料

 

人的外周血

 

實驗步驟

 

1. 在無菌條件下，用20毫升的青霉素瓶分裝5毫升培養(yǎng)液，其中RPMI1640占80％；小牛血清占15—20％；PHA0.2毫升；青霉素 100單位/毫升；鏈霉素100微克/毫升。最后用3.5％NaHCO₃調(diào)節(jié)pH至7.2—7.4。

2. 每5毫升的培養(yǎng)液中加入BrdUrd0.1毫升，最終濃度為10微克/毫升。

3. 每瓶培養(yǎng)液中加入0.3毫升靜脈血，輕輕搖勻，用黑布避光，立即置37℃溫箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)72小時左右，加入秋水仙素0.4—0.8微克/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。

5. 按常規(guī)收集細胞，用0.075mol/LKCl或蒸餾水低滲20分鐘，用甲醇：冰醋酸3：1配制的固定液固定兩次，每次15分鐘，用氣干法制片，一天以后將染色體制片放入70—80℃烤箱中烘烤1—2小時，或放在37℃溫箱中存放備用。

6. 染色體標本的差別染色方法有兩種：

   1) 堿的熱溶液處理：將染色體標本浸在88℃的 1mol/LNaH₂PO₄（pH為8.0）的溶液中，處理20分鐘，取出后立即用蒸餾水沖洗，用常規(guī)Giemsa染色5分鐘，再用蒸餾水沖洗，干燥，觀察。

   2) 紫外燈照射誘發(fā)：染色體標本在37℃條件下擱置24小時后取出，放在45—48℃的水浴鍋上，覆蓋一層2×SSC溶液（0.3mol/LNaCl，0.03mol/L枸櫞酸鈉），15W紫外燈照射20—30分鐘，燈管與載玻片之間距離為6厘米（照光期間防止2×SSC溶液干涸）。照射完畢，用蒸餾水沖去2×SSC，用3％Giemsa（pH6.8磷酸緩沖液稀釋）染色5—10分鐘，水洗，氣干后鏡檢。

7. 在普通光學顯微鏡下觀察，可見姊妹染色單體呈現(xiàn)鮮明的深淺不同的顏色。

 

注意事項

 

1. 在本方法的基礎上，如將培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)液的酸堿度、培養(yǎng)溫度或培養(yǎng)時間等因素略加變動，可適用于其他一些哺乳動物、鳥類或兩棲類動物淋巴細胞的培養(yǎng)，用以觀察它們的姊妹染色單體色差。例如中華大蟾蜍淋巴細胞培養(yǎng)時，所用的培養(yǎng)基組成除RPMI1640外，還補充一定量的水解乳蛋白，培養(yǎng)基的pH為7.0—7.2，培養(yǎng)溫度為26℃。

2. BrdUrd溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，一次使用不完，必須有黑布避光，4℃冰箱保存。

3. BrdUrd在培養(yǎng)開始時加入，或在培養(yǎng)后的24小時加入均可。

4. 用紫外燈照射誘發(fā)姊妹染色單體互換時，如紫外燈功率大，W數(shù)高，照射的時間就相應地減少。

西亞試劑 http://hendrickstechnology.com/ http://www.xiyam.com/