揭示偽裝的干細(xì)胞

我們的免疫系統(tǒng)不僅對(duì)腫瘤疾病的發(fā)展提供持續(xù)的監(jiān)測(cè)，而且還可以人為地重新編程以識(shí)別和根除已建立的惡性腫瘤，這一發(fā)現(xiàn)改變了我們對(duì)腫瘤治療和預(yù)后的看法。單克隆抗體(mAbs)的開發(fā)為抗原靶向癌細(xì)胞鋪平了道路，并導(dǎo)致了嵌合抗原受體(CAR) T細(xì)胞的發(fā)展。這種革命性的細(xì)胞療法在復(fù)發(fā)或難治性急性B淋巴母細(xì)胞白血病中顯示出前所未有的療效，完全緩解率高達(dá)90%。這些結(jié)果可能是由于CD19靶抗原的高水平、均勻表達(dá)和B細(xì)胞發(fā)育不全的耐受性，其持續(xù)耗損與患者的長(zhǎng)期生存相一致。

盡管有廣泛的熱情，但將CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于其他癌癥的嘗試遇到了不可避免的障礙，例如，缺乏健康組織所不具有的安全可操作的腫瘤相關(guān)抗原。其中一個(gè)例子是急性髓系白血病(AML)，其靶抗原[例如CD33、CD123、fms樣酪氨酸激酶3 (FLT3)、c型凝集素樣分子-1]是由造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPCs)或分化的髓系細(xì)胞表達(dá)的(2,3)。與b型白血病和淋巴瘤相反，CAR介導(dǎo)的髓系和HSPCs的長(zhǎng)期缺失不可避免地導(dǎo)致先天免疫的嚴(yán)重缺陷，感染風(fēng)險(xiǎn)增加，潛在的長(zhǎng)期造血發(fā)育不全。在同種異體造血干細(xì)胞移植(HSCT)或CAR-T細(xì)胞可調(diào)耗竭之前，將免疫療法作為橋接治療都是可行的治療選擇。盡管如此，將免疫治療效果限制在相對(duì)較短的時(shí)間窗口可能嚴(yán)重影響根除殘余腫瘤細(xì)胞的能力。通過CRISPR-Cas敲除(KO)來消除供體造血干細(xì)胞中的靶抗原，以避免靶上殺傷。然而，這種方法只適用于造血發(fā)育所必需的基因，從而增加了腫瘤通過抗原丟失或下調(diào)而免疫逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。此外，核酸酶介導(dǎo)的KO不能安全地適應(yīng)多路復(fù)用，這限制了同時(shí)靶向多個(gè)抗原的機(jī)會(huì)。

我和我的同事們假設(shè)，在用于骨髓移植的健康HSPCs中精確設(shè)計(jì)目標(biāo)表位可能會(huì)破壞CAR-T細(xì)胞的結(jié)合，而不影響修飾蛋白的功能，從而完全保留干細(xì)胞的再生和分化能力。關(guān)鍵的是，這種策略使我們能夠靶向?qū)Π籽∩嬷陵P(guān)重要的基因，而不管它們?cè)诮】翟煅械谋磉_(dá)或作用如何，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的抗白血病功效，同時(shí)具有最小的靶內(nèi)或腫瘤外毒性。我們的研究小組證明了通過表位堿基編輯，賦予HSPCs對(duì)靶向AML細(xì)胞上廣泛表達(dá)的三種細(xì)胞因子受體的CAR-T細(xì)胞的選擇性抗性的可能性。 FLT3和KIT是酪氨酸激酶受體，分別在93%和85%的AML病例中表達(dá)。CD123是白細(xì)胞介素-3受體的一個(gè)亞基，白細(xì)胞介素-3受體是一種I型細(xì)胞因子受體，在>75%的AML病例中發(fā)現(xiàn)。這些基因在造血發(fā)育的各個(gè)階段表達(dá)，它們?cè)贏ML中的過度表達(dá)與較低的生存率和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。

通過表位定位文庫(kù)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)單氨基酸替換足以破壞治療性單克隆抗體識(shí)別，盡管保留了表面表達(dá)。因此，cd28共刺激CAR-T細(xì)胞的體外殺傷實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)表位編輯變體的細(xì)胞對(duì)car介導(dǎo)的殺傷具有抗性，不會(huì)引發(fā)T細(xì)胞活化或脫顆粒，而野生型FLT3、KIT或CD123則被消除。由于表位工程可以通過點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)，因此我們推斷，與同源定向修復(fù)相比，堿基編輯(be)可能是一種合適且更安全的選擇，它不需要雙鏈DNA斷裂或模板供體。       通過電穿孔帶有腺嘌呤堿基編輯(sgRNA+ABE)變體的單導(dǎo)RNA，我們?cè)谌祟怌D34+ HSPCs中實(shí)現(xiàn)了高效的表位編輯(~85%)，毒性小，脫靶性好。與先前對(duì)核酸酶介導(dǎo)的編輯的觀察相反，BE效率在批量和更原始的HSC富集亞群中相似。關(guān)鍵的是，F(xiàn)LT3、CD123和KIT的表位修飾可以用相同的ABE進(jìn)行，原則上允許多路復(fù)用。

接下來，我們?cè)u(píng)估了編輯后受體功能的保存(例如，配體親和力、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活、增殖、轉(zhuǎn)錄和磷酸化蛋白質(zhì)組反應(yīng))，并發(fā)現(xiàn)了與野生型受體相當(dāng)?shù)奶卣?，無論是在基線還是在配體刺激下。經(jīng)過編輯的造血干細(xì)胞對(duì)CAR-或單克隆抗體介導(dǎo)的體外殺傷具有耐藥性，并證實(shí)這些“偽裝”的干細(xì)胞即使直接暴露于免疫療法也能存活。在NBSGW小鼠中進(jìn)行的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)再繁殖實(shí)驗(yàn)顯示，原發(fā)性和繼發(fā)性受體均保持了再繁殖和多譜系分化能力。

為了評(píng)估CAR-T細(xì)胞是否能夠在保留表位編輯造血功能(AML免疫治療的“圣杯”之一)的同時(shí)選擇性地消除AML細(xì)胞，我們將HSPCs和人類患者來源的AML異種移植物(PDXs)順序植入NBSGW小鼠。用FLT3-CAR治療的小鼠實(shí)現(xiàn)了AML的完全根除。與此同時(shí)，我們觀察到CD19+的大量消耗僅在腺相關(guān)病毒整合位點(diǎn)1(AAVS1)對(duì)照組中存在造血亞群(前b、前b)、粒細(xì)胞、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞和淋巴細(xì)胞引發(fā)的多能祖細(xì)胞，而移植FLT3-BE HPSC的小鼠則受到保護(hù)。與AAVS1-BE相比，暴露于FLT3-BE造血的CAR-T細(xì)胞顯示出較低的程序性細(xì)胞死亡蛋白1表達(dá)，表明激活和衰竭減少。通過我們方法的概念驗(yàn)證數(shù)據(jù)，我們測(cè)試了表位編輯是否允許多路復(fù)用。當(dāng)暴露于FLT3+CD123 CAR-T細(xì)胞時(shí)，聯(lián)合雙FLT3+CD123 BE能夠在體內(nèi)保護(hù)造血譜系，這反過來可以根除對(duì)FLT3靶向單獨(dú)的PDXs耐藥，強(qiáng)調(diào)了多靶點(diǎn)免疫療法的潛力。

我們的研究提供了證據(jù)，證明正常組織共享的腫瘤相關(guān)抗原可以通過精確修飾健康細(xì)胞中的靶表位來安全靶向，從而賦予它們選擇性抗性并產(chǎn)生人工白血病限制抗原。在我們的工作中開發(fā)的創(chuàng)新工具可以提高癌癥免疫治療的治療指數(shù)，并使長(zhǎng)期抗腫瘤維持。此外，通過限制對(duì)白血病細(xì)胞的靶向活性，表位編輯可以減少CAR-T細(xì)胞暴露的抗原負(fù)擔(dān)，減少不希望的CAR-T細(xì)胞刺激和衰竭。最后，表位編輯可以很容易地實(shí)現(xiàn)多路復(fù)用，以實(shí)現(xiàn)聯(lián)合治療，同時(shí)避免重疊的毒性。盡管關(guān)于復(fù)雜基因組工程細(xì)胞療法的臨床可行性的幾個(gè)問題仍未得到解答，但我們認(rèn)為，當(dāng)靶向或非腫瘤毒性是成功翻譯的關(guān)鍵限制因素時(shí)，表位工程是開發(fā)更安全、更有效的免疫療法的關(guān)鍵成就。

來源：AAAS

亞氯酸鈉（Sodium hypochlorite，化學(xué)式：NaClO）是一種無色或淡黃色液體，常用作漂白劑和消毒劑。以下是亞氯酸鈉的一些化學(xué)性質(zhì)：

1. 氧化性：亞氯酸鈉是一種氧化性化合物，能夠與許多物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)。

2. 氯化性：亞氯酸鈉在水中能夠迅速分解，生成次氯酸（HClO）和氫氧化鈉（NaOH）。亞氯酸是一種比亞氯酸鈉更強(qiáng)的氧化劑。

3. 消毒性：亞氯酸鈉具有較強(qiáng)的殺菌消毒作用，可用消毒水源、池塘和水處理。

4. 漂白性：亞氯酸鈉可用作漂白劑，能夠?qū)⒃S多染料和有機(jī)物氧化漂白。

5. 不穩(wěn)定性：亞氯酸鈉在陽(yáng)光照射下會(huì)逐漸分解，所以需要存放在暗處，避免陽(yáng)光直射。

需要注意的是，亞氯酸鈉是一種腐蝕性較強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，在處理和使用時(shí)應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施。同時(shí)，避免與酸性物質(zhì)或易燃物質(zhì)接觸，以免引發(fā)危險(xiǎn)反應(yīng)。