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西亞試劑：利用印刷電極實(shí)現(xiàn)HIV蛋白酶的電化學(xué)檢測(cè)

 艾滋?。ˋIDS）全稱(chēng)“獲得性免疫缺陷綜合癥（acquired  immunodeficiency  syndrome,  AIDS）”，是一種由逆轉(zhuǎn)錄病毒——“人類(lèi)免疫缺陷病毒（human  immunodeficiency  virus，HIV）”引起的人體免疫防御系統(tǒng)機(jī)能缺陷，繼而發(fā)生嚴(yán)重致命性感染的傳染病[1]。艾滋病的死亡率極高，并且在全球的蔓延速度驚人。根據(jù)聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織2006年11月21日共同發(fā)布的《2006年全球艾滋病報(bào)告》，2006年全球艾滋病病毒感染人數(shù)達(dá)到3950萬(wàn)，而2006年每天大約有1.1萬(wàn)人新感染艾滋病病毒，95％的感染者分布在中、低收入國(guó)家[2]。2007年8月19日-23日，第八屆亞洲－太平洋地區(qū)艾滋病國(guó)際會(huì)議在斯里南卡首都科倫坡舉行。會(huì)議上來(lái)自70多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的2500多名代表，就增強(qiáng)亞太地區(qū)乃至全球?qū)Π滩〉姆乐喂ぷ?，推?dòng)艾滋病預(yù)防、治療和護(hù)理服務(wù)的普及等進(jìn)行了討論[3]。目前，公認(rèn)療效最好的“雞尾酒療法”也只能延緩艾滋病人的死亡，并不能徹底治愈艾滋病。所以，對(duì)于艾滋病有效治療靶點(diǎn)及其抑制劑的研究仍是備受關(guān)注的領(lǐng)域。

    2007年8月份，加拿大Saskatchewan大學(xué)Kraatz教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組公布了他們?cè)诎滩≈委熝芯糠矫嫒〉玫淖钚逻M(jìn)展[4]。該工作題為“HIV－1型蛋白酶的電化學(xué)檢測(cè)方法”（An  electrochemical  approach  for  the  detection  of  HIV-1  protease）發(fā)表在英國(guó)皇家化學(xué)學(xué)會(huì)刊物Chem.  Commum.上。Kraatz研究小組利用自己合成的二茂鐵－抑肽素加合物為探針構(gòu)建了基于印刷電極的傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了HIV－1型蛋白酶的快速、方便的電化學(xué)檢測(cè)。用于檢測(cè)的印刷金電極如圖1所示。  

    HIV－1型蛋白酶是HIV病毒粒子組裝、成熟過(guò)程不可缺少的酶類(lèi)，抑制其活性能夠阻止未成熟的病毒粒子發(fā)育成具有感染性的HIV病毒。因此，HIV－1型蛋白酶成為抗AIDS治療的重要靶點(diǎn)。HIV－1型蛋白酶屬于一種分泌酶（aspartyl  protease）。抑肽素（pepstatin）可以和分泌酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，強(qiáng)烈抑制該類(lèi)酶的活性[4]。Kraatz研究小組合成了二茂鐵－抑肽素加合物（feerocene－conjugated  pepstatin），結(jié)構(gòu)如圖2所示。  

    這種“生物有機(jī)金屬化合物”通過(guò)二茂鐵一端修飾的巰基與金表面形成“金－硫鍵”固定于金電極表面，同時(shí)以二茂鐵作為電化學(xué)信號(hào)指示探針，抑肽素作為HIV－1型蛋白酶的結(jié)合探針，利用電化學(xué)方法對(duì)HIV－1型蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示。采用印刷金電極則有利于該傳感器的大規(guī)模生產(chǎn)及商品化。  

    “二茂鐵－抑肽素加合物”固定到印刷金電極表面后，施加一定范圍電位時(shí),二茂鐵產(chǎn)生特征電化學(xué)信號(hào)，如圖3A所示。溶液中的HIV－1型蛋白酶與金電極表面固定的抑肽素結(jié)合后，能夠顯著改變二茂鐵的電化學(xué)行為，如圖3B所示。通過(guò)HIV－1型蛋白酶與抑肽素結(jié)合前后二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)的不同，可以檢測(cè)出HIV－1型蛋白酶。二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)（如氧化還原適電位及峰電流）與結(jié)合的HIV－1型蛋白酶的量成一定比例關(guān)系。如圖4A所示，隨著HIV－1型蛋白酶濃度增大，二茂鐵的氧化還原電位逐漸正移，峰電流逐漸降低。根據(jù)氧化還原適電位及峰電流密度值可以計(jì)算所結(jié)合的蛋白酶的量（如圖4B，4C所示）。  

    這種電極還可以用于HIV－1型蛋白酶抑制劑的研究。松胞菌素A（Cytochalasin  A）也是一種HIV－1型蛋白酶的抑制劑，并且可以和抑肽素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HIV－1型蛋白酶[4]。當(dāng)溶液中存在松胞菌素A時(shí)，就會(huì)減少蛋白酶和電極表面抑肽素的結(jié)合，從而可以通過(guò)二茂鐵電化學(xué)信號(hào)改變測(cè)量松胞菌素A。如圖5A所示，在含有相同濃度HIV－1型蛋白酶時(shí)，溶液中松胞菌素A濃度越大，由于蛋白酶結(jié)合造成的二茂鐵電化學(xué)信號(hào)改變就越小，相應(yīng)的二茂鐵氧化還原適電位及峰電流密度也與松胞菌素A濃度成一定比例關(guān)系（如圖5B，5C所示）。  

    Kraatz研究小組希望將這種二茂鐵－肽鏈加合物修飾電極進(jìn)一步推廣應(yīng)用于其他具有重要臨床意義，非電活性蛋白質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，他們發(fā)展的這種方法有望在體液等復(fù)雜環(huán)境下檢測(cè)蛋白質(zhì)，這對(duì)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速、方便檢測(cè)具有重要意義。另外，研究人員認(rèn)為通過(guò)該方法與生物芯片系統(tǒng)的整合，他們可以進(jìn)行多種HIV相關(guān)蛋白的同時(shí)檢測(cè)，及HIV－1型蛋白酶抑制劑的高通量篩選。電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)及印刷電極的使用則使該蛋白質(zhì)檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)便易于商品化推廣，顯示出非常樂(lè)觀的應(yīng)用前景。