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摘要：DNA疫苗又稱為核酸疫苗，是20世紀90年代初發(fā)展起來的一種全新疫苗，具有能夠激發(fā)機體體液和細胞免疫反應，核酸疫苗因高效、持久、廣譜、簡便、廉價、無致病性等特點，被作為一種新型的疫苗而得到廣泛的研究和應用，是近年來研究的一個熱點。抗原編碼基因的選擇、質(zhì)粒的構(gòu)建、各種佐劑的應用以及疫苗接種方法和途徑等因素可以提高和改變DNA疫苗的免疫效果與反應類型。DNA疫苗不僅有預防疾病的作用，同時還具有治療疾病的作用。在不久的將來，DNA疫苗有望成為人類防治疾病的重要手段。
關(guān)鍵詞：DNA疫苗；抗原基因；免疫機制
DNA疫苗是20世紀90年代發(fā)展起來的新型疫苗，是繼減毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA疫苗(DNAvaccine)是由插入一種或多種外源基因的質(zhì)粒DNA(來自細菌)和真核啟動調(diào)控基因等元件構(gòu)成的，載有外源抗原的質(zhì)粒DNA在一種真核啟動子和加尾信號以及相關(guān)增強子等基因單元的控制下，可在哺乳動物的各類細胞中表達出相關(guān)的抗原蛋白[1]。將重組有外源抗原編碼基因的質(zhì)粒，利用某種方法直接導入人或動物的細胞內(nèi)，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，在被免疫對象機體的活體細胞合成抗原蛋白，從而誘導機體產(chǎn)生免疫應答。
1DNA疫苗的組成
DNA疫苗由病原抗原編碼基因及質(zhì)粒載體兩部分組成?？乖蚩梢允菃蝹€基因或完整的一組基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段核苷酸序列。DNA疫苗載體質(zhì)粒一般以質(zhì)粒為基本骨架。常用的質(zhì)粒載體有pSV2、pRSV、pcDNA3.1、pCI和pVAX1等。這些源于大腸埃希菌的質(zhì)粒載體可在真核細胞中表達外源基因，理論上，它們的結(jié)構(gòu)包括兩種不同的單元促使抗原合成的轉(zhuǎn)錄復合單元，一套用于表達大腸埃希菌，另一套用于在宿主細胞內(nèi)表達。它含有一啟動子/增強子，帶有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子，編碼抗原蛋白的基因序列以及多聚polyA加尾信號，啟動子多采用CMV、SV40、RSV、LTR及肌動蛋白啟動子序列，它們都具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，在多種動物細胞中能高效表達；原核細胞元件，如復制起點、多克隆位點以及有利于重組載體的構(gòu)建并可加速其在細菌中增殖和擴增的選擇標志，且質(zhì)粒的基本骨架中還有促T細胞激活的免疫刺激序列(ISS)[2-3]。
2CpG免疫刺激的作用
DNA疫苗中具有免疫刺激活性的結(jié)構(gòu)基礎是非甲基化的CpG基序(CpGmotif)，又稱為免疫刺激序列(immunostimulatorysequences，ISS)。
目前，寡核苷酸免疫刺激機理尚不清楚。含有CpG序列的寡核苷酸可刺激鼠B細胞增生和免疫球蛋白的產(chǎn)生，并可在體內(nèi)及體外誘導T、B細胞和自然殺傷細胞分泌某些細胞因子，如IL-6、IL-12和IFN-γ。寡核苷酸的免疫調(diào)節(jié)作用與序列結(jié)構(gòu)有關(guān)，一般認為B細胞有效的活化須具有5′端兩個嘌呤、3′端兩個嘧啶的CpG基序，能夠序列特異性和非序列特異性地結(jié)合血清中的病毒和細胞蛋白，并非特異性地激活轉(zhuǎn)錄因子Spl[4]。CpG基序可誘生細胞毒性T淋巴細胞，這可能是因B細胞的活化促進了共刺激分子(CD86和CD25)的表達，或因CpG基序改變了T細胞對T細胞受體活化信號的敏感性而造成。Sato等發(fā)現(xiàn)，將β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因整合入含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒后，表達β-Gal的水平比整合到含氨芐抗性基因的質(zhì)粒要高，但誘導的抗β-Gal的抗體水平則相反。進一步研究發(fā)現(xiàn)，氨芐抗性基因中含有兩個重復的未甲基化的AACGT序列，而卡那霉素抗性基因則沒有。將此序列插入含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒載體中可提高誘生抗β-Gal的抗體水平，并有效地誘導產(chǎn)生了較高的IgG、CTLs和IFN-γ。AACGT是已經(jīng)證實了的具有免疫刺激活性的CpG基序，因此人們設想可以把DNA疫苗結(jié)構(gòu)分為編碼抗原區(qū)和骨架區(qū)，期望可以通過增加骨架結(jié)構(gòu)中的免疫刺激CpG基序提高疫苗的免疫效果，但還需更多研究[5-7]。
研究發(fā)現(xiàn)CpG基序常以PuPuCpGPyPy的形式出現(xiàn)于細菌基因組DNA序列和質(zhì)粒中，出現(xiàn)頻率為1/16；而脊椎動物中較少，出現(xiàn)頻率為1/50。原核細胞CpG中的胞苷酸的甲基化不足5%，而真核則達70%～90%。對于脊椎動物免疫系統(tǒng)來說，能夠識別原核生物DNA中以未甲基化的CpG為核心的CpG序列，產(chǎn)生免疫激發(fā)，而且針對CpG兩側(cè)不同的脫氧核苷酸順序分泌不同種類的細胞因子。
3DNA疫苗的免疫應答機制
DNA質(zhì)粒被導入宿主細胞后，病原體抗原的基因片段在宿主細胞內(nèi)得到表達并合成抗原，再經(jīng)過加工、處理、修飾遞呈給免疫系統(tǒng)，激發(fā)免疫應答。這一過程類似于病原微生物感染或減毒活疫苗接種，所以DNA疫苗能有效地激發(fā)體液免疫和細胞免疫，尤其是其具有激活殺傷性T淋巴細胞的作用。
3.1細胞介導的免疫反應
3.1.1MHCⅠ途徑DNA疫苗接種機體后，質(zhì)粒被周圍細胞攝取并被細胞質(zhì)中的酶復合物-蛋白酶體所降解，形成9個～13個氨基酸的肽段，然后經(jīng)抗原轉(zhuǎn)運蛋白(TAP)轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進一步修飾成8個～10個氨基酸的短肽。這些短肽(抗原表位)片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與新合成的MHCⅠ分子的抗原結(jié)合槽相結(jié)合，形成抗原肽-MHCⅠ分子復合物，并經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運至細胞表面作為免疫原信號供CD8＋CTL所識別，導致其活化、增殖并分化為具有殺傷能力的效應CTL(Tc)，誘導產(chǎn)生較強的細胞免疫反應[3,9]。這些效應Tc細胞可以類似于NK細胞的機制，通過釋放穿孔素和顆粒酶殺死病毒感染的細胞，使其發(fā)生溶解從而限制病毒感染的擴散。此外，效應CTL還可通過產(chǎn)生細胞因子等非溶細胞機制來抑制病毒。
目前認為，DNA導入皮膚后，由于肌細胞是不可再分裂的細胞，因此質(zhì)?？稍诩〖毎虚L時間保留從而使外源DNA得以長期的表達。此外，由于肌細胞幾乎包括所有類型的細胞，如專職抗原遞呈細胞(朗罕氏細胞、樹突細胞)等，因此肌細胞都可以攝取和表達抗原，或接受鄰近其他細胞遞呈的抗原，再遞呈給組織內(nèi)同樣較豐富的Th和CTL細胞[10]，或鄰近的淋巴組織。這可能也是皮膚導入途徑通常只需要極少量外源DNA的原因。但是肌細胞MHCⅠ分子的低表達使人們對其抗原遞呈的能力表示懷疑。Ulmer等利用體外轉(zhuǎn)染的方式將含有抗原基因的成肌細胞移植于同系小鼠的肌肉內(nèi)后發(fā)現(xiàn)其能夠有效激活CTL活性，并誘導產(chǎn)生了相應抗體；同時，他將此H-2k背景的成肌細胞接種到H-2d×H-2k雜交一代小鼠發(fā)現(xiàn)：激活的CTL不僅具有H-2k限制性識別，同時也具有H-2d的限制性識別。因而，他認為肌細胞表達抗原足以激活機體產(chǎn)生有效免疫，同時鄰近的肌細胞亦可以獲得其傳遞的抗原并進行遞呈，從而激活機體的免疫應答。進一步的試驗證明髓源的抗原遞呈細胞(APC)亦參與特異性CTL的誘導，且效率高于肌細胞。
在骨髓重構(gòu)試驗中，注射F1-骨髓重構(gòu)鼠中的親本細胞在單倍型體細胞和骨髓源細胞間產(chǎn)生錯配；DNA接種后的免疫反應對重構(gòu)骨髓的單倍型有嚴格的限制。這些結(jié)果清楚說明骨髓源性細胞在DNA接種后的免疫反應激活中起著非常關(guān)鍵的作用
髓源性的APC(如樹突狀細胞，巨噬細胞等)可以通過兩條途徑參與抗原遞呈：①經(jīng)肌肉注射的質(zhì)粒DNA直接被周圍的APC(包括局部的組織細胞、專職APC或其他有核細胞)攝取，使質(zhì)粒攜帶的抗原基因得以在APC內(nèi)表達，經(jīng)加工處理后進人MHCⅠ類分子限制性的抗原遞呈途徑；②質(zhì)粒DNA經(jīng)肌細胞攝取后，在其內(nèi)加工合成的抗原通過某種方式傳遞給APC，而后再進入MHCⅠ類分子的抗原遞呈途徑[14]。
3.1.2MHCⅡ途徑MHCⅡ類分子的α與β鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與Ii鏈(invariantchain)非共價結(jié)合，Ii鏈與MHCⅡ分子的抗原結(jié)合部位的結(jié)合有效阻止了胞質(zhì)中未成熟的內(nèi)源性抗原與MHCⅡ類分子的結(jié)合。Ii與MHCⅡ類分子結(jié)合形成的復合體經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運至內(nèi)體(endsome)，在某些蛋白水解酶和低pH條件下Ii鏈與MHCⅡ類分子發(fā)生解離。外源蛋白降解成至少含13個氨基酸的肽段，通常為17個氨基酸。這些短肽片段(抗原表位)再與MHCⅡ類分子結(jié)合，形成抗原肽-MHCⅡ類分子復合物，被遞呈至抗原遞呈細胞表面，為輔助T淋巴細胞(Th細胞)所識別，導致Th細胞活化、增殖、分化為效應Th細胞，并分泌一系列的細胞因子(IL-2、IL-4、IL-2、TNF等)，從而發(fā)揮Th細胞的輔助效應。輔助T淋巴細胞有兩類：Th1主要介導細胞免疫反應，活化巨噬細胞的產(chǎn)生；Th2主要介導體液免疫反應，誘導B淋巴細胞的活化及抗體的產(chǎn)生。
3.2體液免疫
DNA疫苗激活B細胞反應較T細胞反應滯后，這是因為抗體的產(chǎn)生有賴于完整抗原被B細胞所識別，而抗原進入細胞表面或間隙是被B細胞識別的前提。異源抗原被B淋巴細胞表面的免疫球蛋白所識別后，啟動受體介導的內(nèi)吞作用，被吞入的抗原分子經(jīng)水解成為免疫原性多肽，與MHCⅡ類分子結(jié)合后表達于細胞表面，并遞呈給CD4＋T細胞，促使其活化并分化為Th2細胞，產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-6及CD40的配體分子。在Th2型細胞因子的作用下，B細胞活化、增殖、分化為漿細胞，合成并分泌抗體，產(chǎn)生體液免疫應答。產(chǎn)生的抗體主要為IgG，此外還有少量的IgM和IgA。對甲型流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，用保守核蛋白(NP)接種小鼠所產(chǎn)生的抗血清對病毒復制無抑制作用，而接種NP質(zhì)粒的小鼠獲得的抗血清可有效地抑制病毒復制。可見，基因免疫接種和抗原免疫接種所獲得的體液免疫在質(zhì)和量上存在一定差異。
4DNA疫苗的優(yōu)點與安全性
DNA疫苗作為第3代疫苗，具有其自身的特點。
4.1DNA疫苗的優(yōu)點
4.1.1易操作性和穩(wěn)定性對于質(zhì)粒來說，不管其編碼序列如何，都可用相同的方法純化和處理，并且干燥的DNA質(zhì)粒在室溫下相對穩(wěn)定，這一點決定了DNA疫苗在熱帶地區(qū)應用的優(yōu)越性。另外，由于其易操作性和穩(wěn)定性，也決定了DNA疫苗生產(chǎn)成本相對低廉，這就為DNA疫苗在發(fā)展中國家的大規(guī)模使用鋪平了道路。
4.1.2免疫效果好DNA疫苗在宿主細胞內(nèi)表達，其加工處理過程與病毒感染的自然過程相似，抗原遞呈過程也相同，從而以自然的形式被加工后以天然構(gòu)象遞呈給宿主的免疫識別系統(tǒng)，激發(fā)較強的免疫應答。
4.1.3重組質(zhì)粒DNA在宿主體內(nèi)存在時間長持續(xù)刺激機體產(chǎn)生廣泛的體液免疫應答和細胞免疫應答，產(chǎn)生持久免疫。選擇核心蛋白保守DNA序列制備基因疫苗，避免免疫逃脫現(xiàn)象。同時DNA疫苗能刺激黏膜免疫發(fā)生，誘導免疫記憶反應[15-18]。
4.1.4DNA疫苗可用于癌癥等疑難病癥的治療研究表明，向小鼠體內(nèi)注射編碼抗體可變區(qū)基因的質(zhì)粒可產(chǎn)生獨特型抗體，抗體可變區(qū)基因疫苗可用于治療B淋巴瘤。有人把編碼人癌胚抗原(CEA)的質(zhì)粒注入到小鼠舌中之后，引起了針對CEA的特異性細胞免疫和體液免疫，這一結(jié)果為治療人類結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等疾病帶來希望。
4.1.5DNA疫苗可用于變異頻繁或血清型較多的病原免疫預防DNA疫苗在對變異頻繁或血清型較多的病原免疫預防過程中，對于目前多價活毒疫苗防治的疾病預防和治療有重要意義。易變異的病原如流感病毒、輪狀病毒、藍舌病病毒、口蹄疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒。
4.1.6質(zhì)粒DNA無免疫原性，可以反復使用這一特點對具有母源抗體的動物尤為重要。
4.2DNA疫苗的安全性
DNA疫苗具有傳統(tǒng)疫苗所沒有的優(yōu)越性，但是真正運用于人體還有許多問題有待解決。
載體DNA整合到宿主基因組內(nèi)，有導致不利轉(zhuǎn)化的可能，如通過癌基因的插入，導致宿主原癌基因的插入活化或抑癌基因的失活等，如果基因疫苗散布到生殖細胞，并發(fā)生整合，則影響更為深遠[18-22]。
免疫效果有待提高。實驗動物越大，基因免疫效果越差，在小鼠試驗中，檢測到抗體反應高，而到其它大型的動物效果就不是很明顯。
抗DNA免疫反應。質(zhì)粒DNA會不會誘發(fā)抗雙鏈DNA的自身免疫反應，可能引起自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)，正常人體中可以存在抗菌ssDNA和dsDNA抗體，而不存在抗自身的dsDNA抗體。利用細菌DNA免疫接種，可以誘導產(chǎn)生抗哺乳動物ssDNA抗體，但無抗哺乳動物dsDNA抗體的。還有DNA疫苗中含原核基因組中常見的CpG基序，易形成抗原決定簇[21]。
5結(jié)語
DNA疫苗開創(chuàng)了免疫學和疫苗學的新領域。越來越多的試驗研究發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗在免疫防御方面有良好的效果，但DNA疫苗還面臨著許多挑戰(zhàn)，比如DNA疫苗接種的免疫學機理，有關(guān)核酸疫苗在理論上的安全性問題等方面，還需要進一步的試驗加以闡明。
現(xiàn)在普遍認為，DNA疫苗應先用在傳統(tǒng)方法無法對付的病原體和疾病上。如HIV、肺結(jié)核、瘧疾、乙肝、丙肝、流感和支原體等。在另一個方面，DNA疫苗的優(yōu)勢是它的治療作用。相信隨著研究的深化，DNA疫苗將會逐一解決現(xiàn)有的問題，在更多的領域中發(fā)揮作用。
