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西亞試劑：細(xì)菌毒素蛋白可直接修飾泛素蛋白的致病機(jī)制

人類(lèi)的歷史，某種程度上就是與細(xì)菌不斷“斗爭(zhēng)”的歷史。然而，我們并未“知己知彼”。

近日，北京生命科學(xué)研究所高級(jí)研究員邵峰及其科研團(tuán)隊(duì)在世界上首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌毒素蛋白可以直接修飾泛素蛋白的致病機(jī)制。該機(jī)制的發(fā)現(xiàn)將為抗菌類(lèi)新藥的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和策略性的提示，這對(duì)掌握和了解病原細(xì)菌致病機(jī)理和建立有效防治手段有重要意義。美國(guó)Science雜志日前在線發(fā)表了這一成果。

眾所周知，生物體是一部程序精準(zhǔn)、分工明確的“復(fù)雜機(jī)器”。在生物體內(nèi)，被稱(chēng)為泛素的一類(lèi)蛋白，主要負(fù)責(zé)將老化和即將廢棄的蛋白質(zhì)貼上“死亡標(biāo)簽”，然后把其運(yùn)送到細(xì)胞體內(nèi)的“垃圾桶”中，切割成較小的片段毀壞或重新加以利用。這一信號(hào)途徑在生物體中非常重要，如果該信號(hào)系統(tǒng)被破壞，細(xì)胞將無(wú)法行使正常功能，器官也不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

因此，對(duì)泛素分子的研究一直是生物科學(xué)領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)。邵峰團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)了病原細(xì)菌的毒素效應(yīng)蛋白可直接共價(jià)修飾宿主泛素蛋白本身，從而導(dǎo)致泛素和泛素類(lèi)蛋白失活，使宿主體內(nèi)的泛素信號(hào)系統(tǒng)功能紊亂的機(jī)制。

不僅如此，邵峰團(tuán)隊(duì)還開(kāi)創(chuàng)了利用細(xì)菌毒素蛋白研究泛素信號(hào)系統(tǒng)的新視角。在這一發(fā)現(xiàn)中，他們不僅提出了細(xì)菌通過(guò)分泌毒素效應(yīng)蛋白致病的最新機(jī)制，還對(duì)宿主細(xì)胞的泛素蛋白信號(hào)通路有了新的認(rèn)識(shí)和了解。

“我們主要致力于細(xì)菌致病機(jī)理的研究，不過(guò)這不是唯一目的。不同的病原體為我們深入研究宿主自身的信號(hào)通路提供了獨(dú)特的視角和窗口。”邵峰說(shuō)，億萬(wàn)年來(lái)，為了生存，細(xì)菌需要不斷適應(yīng)宿主，它們和宿主共同進(jìn)化。他們目前的工作正是希望從“敵人”那里了解“自己”，將不同種屬的病原細(xì)菌、細(xì)菌突變株以及細(xì)菌的毒素蛋白作為工具，來(lái)闡述宿主細(xì)胞自身的機(jī)理。

“這些成功還取決于擁有多方向多種類(lèi)的實(shí)驗(yàn)手段。我們整合生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多種，從不同的角度探索和解決同一個(gè)科學(xué)問(wèn)題。”邵峰介紹說(shuō)，“下一步，我們還將繼續(xù)研究被病原菌修飾的泛素信號(hào)通路發(fā)生功能紊亂的深入機(jī)理；并將以不同的病原菌作為研究工具，系統(tǒng)地闡述宿主抵抗侵染和發(fā)生炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。”這可能為設(shè)計(jì)抗炎癥藥物提供新的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和理論啟示。

2010年8月5日，我所邵峰博士實(shí)驗(yàn)室在Science  雜志(Science  Express)發(fā)表題為“Glutamine  deamidation  and  dysfunction  of  ubiquitin/NEDD8  induced  by  a  bacterial  effector  family”的文章。該文章報(bào)道了病原細(xì)菌效應(yīng)蛋白通過(guò)直接共價(jià)修飾并失活宿主細(xì)胞中的泛素和泛素類(lèi)蛋白從而導(dǎo)致宿主泛素信號(hào)通路發(fā)生功能紊亂的新的致病機(jī)制。

通過(guò)三型分泌系統(tǒng)分泌效應(yīng)分子進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而阻斷或調(diào)節(jié)宿主關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是許多病原菌普遍采用的致病機(jī)制。尋找效應(yīng)分子在宿主細(xì)胞中的靶蛋白并闡明其作用于靶蛋白及相關(guān)信號(hào)通路的生物化學(xué)機(jī)理對(duì)我們了解病原菌致病機(jī)理和建立有效防治手段有著重要的意義。同時(shí)，這也可能促進(jìn)我們對(duì)真核細(xì)胞本身信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的進(jìn)一步理解。

來(lái)自類(lèi)鼻疽桿菌(Burkholderia  pseudomallei)的CHBP和來(lái)自致病性大腸桿菌（Enteropathogenic  E.  coli）的Cif是一類(lèi)具有木瓜蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域的三型分泌效應(yīng)蛋白，這類(lèi)效應(yīng)分子具有阻斷宿主細(xì)胞周期的活性。在這項(xiàng)研究中，邵峰小組首先發(fā)現(xiàn)CHBP具有很強(qiáng)的抑制真核細(xì)胞的泛素鏈形成（ubiquitination）的活性，這種活性依賴(lài)于CHBP的類(lèi)木瓜蛋白酶的催化活性。一系列的生化實(shí)驗(yàn)分析揭示了泛素（ubiquitin）蛋白第40位的谷氨酰胺（Gln-40）在CHBP的作用后發(fā)生了脫氨反應(yīng)，變成了谷氨酸。因此，CHBP性質(zhì)上是一個(gè)泛素脫氨酶（deamidase）。利用分子生物學(xué)的方法直接將泛素的Gln-40突變?yōu)楣劝彼岷?，不管是在體外還是在細(xì)胞內(nèi)，這樣的突變泛素分子都喪失了形成泛素鏈的活性。在進(jìn)一步檢測(cè)了CHBP是否也作用其他泛素類(lèi)蛋白時(shí)，邵峰小組發(fā)現(xiàn)CHBP能夠，也只能夠?qū)σ粋€(gè)叫做NEDD8的泛素類(lèi)蛋白起同樣的脫氨修飾作用，并且活性要更強(qiáng)一些。在Burkholderia的感染宿主細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，他們也驗(yàn)證了通過(guò)三型分泌系統(tǒng)分泌的CHBP能夠?qū)е滤拗骷?xì)胞中幾乎所有的NEDD8和大約一半的泛素分子發(fā)生脫氨化修飾。

有趣的是，當(dāng)用帶有Cif的致病性大腸桿菌感染宿主細(xì)胞時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)NEDD8被完全修飾，而泛素卻一點(diǎn)都沒(méi)有。這與體外觀察到的Cif對(duì)NEDD8有很強(qiáng)的偏好性是一致的。在感染的細(xì)胞中，只有受Cullin泛素連接酶復(fù)合物調(diào)控降解的底物蛋白的泛素化和降解受到了明顯的抑制作用。NEDD8的功能是和Cullin蛋白發(fā)生類(lèi)似于單泛素化的共價(jià)修飾（這個(gè)修飾作用也被叫做neddylation）。已知NEDD8修飾可以大大增強(qiáng)Cullin泛素連接酶復(fù)合物的活性，但令人吃驚的是，當(dāng)Cullin分子被經(jīng)過(guò)脫氨的NEDD8修飾后，其泛素連接酶活性不僅沒(méi)有被上調(diào)，反而卻受到了極大的抑制。這個(gè)結(jié)果完美地解釋了體內(nèi)觀察到的Cullin底物泛素化和降解受到特異性抑制的現(xiàn)象。更進(jìn)一步，在真核細(xì)胞中直接異位表達(dá)脫氨化的NEDD8能夠模擬致病性大腸桿菌的感染作用，這些作用包括Cullin底物的特異性積累，細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)受到抑制，以及細(xì)胞出現(xiàn)很強(qiáng)的應(yīng)力纖維。事實(shí)上，應(yīng)力纖維的出現(xiàn)正是由于邵峰實(shí)驗(yàn)室此前的研究中發(fā)現(xiàn)的CUL3/BACURD泛素連接酶復(fù)合物（Chen  et  al.,  Molecular  Cell,  2009）在NEDD8被脫氨后，其泛素化和降解RhoA的功能受到了抑制。

這項(xiàng)研究揭示了一種全新的、通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白直接修飾宿主中泛素和泛素類(lèi)蛋白（NEDD8）從而阻斷宿主泛素化通路的病原菌致病機(jī)制。更為重要的是，這種對(duì)泛素和NEDD8的特異性脫氨修飾也為我們研究蛋白質(zhì)泛素化的機(jī)制（為何Gln-40脫氨化的泛素不能在泛素連接酶催化下成泛素鏈）以及NEDD8是如何活化Cullin泛素連接酶的生物化學(xué)機(jī)制研究提供了一個(gè)新的、獨(dú)特的研究途徑和思路。這項(xiàng)研究也有力地說(shuō)明對(duì)病原菌效應(yīng)蛋白的研究可以為我們了解真核本身的細(xì)胞生物化學(xué)機(jī)制提供獨(dú)特的角度，有著重要的意義。

博士研究生崔霽欣為本文第一作者；研究生姚慶和李珊對(duì)本項(xiàng)研究也有重要貢獻(xiàn)；其他參與此項(xiàng)工作的還有邵峰小組的陸秋鶴博士和技術(shù)員柳麗萍；蛋白質(zhì)組中心的丁小軍和陳涉也參與了部分研究工作；本研究也得到了華盛頓大學(xué)的毛海濱博士和鄭寧教授的幫助；邵峰博士為本文通訊作者。

此項(xiàng)研究為科技部863和北京市科委資助課題，完全在北京生命科學(xué)研究所完成